星形胶质细胞PKM2基因缺失通过破坏乳酸穿梭加重创伤性脑损伤后神经元死亡的作用与机制研究

《Cell Death Discovery》：Effects of astrocytic PKM2 gene deletion on neuronal death following traumatic brain injury

本刊推荐：创伤性脑损伤（TBI）后继发性损伤常导致严重的神经功能障碍。为解决神经元能量代谢危机问题，韩国翰林大学Sang Won Suh团队聚焦于星形胶质细胞丙酮酸激酶M2（PKM2）在星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（ANLS）中的关键作用。研究发现，特异性敲除星形胶质细胞PKM2基因会通过降低乳酸脱氢酶A（LDHA）、单羧酸转运蛋白4（MCT4）等表达，破坏ANLS功能，加剧TBI后氧化损伤、微管紊乱和神经元死亡；而外源性乳酸补充则可有效改善认知功能并促进神经元存活。该研究揭示了靶向星形胶质细胞代谢重编程作为TBI治疗新策略的巨大潜力。

　　

当头部遭受猛烈撞击，创伤性脑损伤（Traumatic Brain Injury, TBI）不仅会立即造成脑水肿和出血等原发性损伤，更会引发一系列复杂的次级损伤级联反应，包括氧化应激、神经炎症和线粒体功能障碍，最终导致大量神经元死亡和长期的认知功能衰退。在全球范围内，TBI是导致脑损伤的主要原因之一，仅在美国每年就有约160万例病例，给公共卫生系统带来沉重负担。面对这一严峻挑战，医学界一直在积极探索有效的神经保护策略。近年来，大脑能量代谢，特别是不同脑细胞之间的代谢协作，被视为干预TBI后神经损伤的一个充满希望的新方向。

其中，星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（Astrocyte-Neuron Lactate Shuttle, ANLS）假说尤为引人注目。该假说认为，在活跃或应激状态下，星形胶质细胞会大量摄取葡萄糖并通过糖酵解产生乳酸，然后将乳酸转运给神经元作为主要的能量底物。乳酸在神经元内被乳酸脱氢酶B（LDHB）转化回丙酮酸，进入三羧酸循环，高效产生三磷酸腺苷（ATP）。在这个精密的代谢合作中，星形胶质细胞内的丙酮酸激酶M2（Pyruvate Kinase M2, PKM2）扮演着至关重要的角色。PKM2是糖酵解途径中的关键限速酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸的最后一步。除了经典的酶活性外，PKM2还能进入细胞核，作为转录共激活因子与低氧诱导因子-1α（HIF-1α）、磷酸化信号转导与转录激活因子3（P-STAT3）等相互作用，从而调控包括乳酸脱氢酶A（LDHA）在内的多种代谢相关基因的表达。那么，在TBI的应激环境下，星形胶质细胞中的PKM2是否通过调节ANLS来影响神经元的命运？特异性干预星形胶质细胞的PKM2是否会成为治疗TBI的新靶点？为了回答这些问题，由Sang Won Suh领衔的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新研究成果。

本研究综合运用了多种关键技术方法。在动物模型上，研究人员利用Aldh1l1-CreERT2; PKM2^f/f转基因小鼠，通过他莫昔芬诱导实现星形胶质细胞特异性PKM2基因条件性敲除（Conditional Knockout, cKO），并建立了可控皮质撞击（Controlled Cortical Impact, CCI）TBI模型。在细胞模型上，采用了原代神经元培养及体外划痕（Scratch）模型模拟损伤。分析手段包括PCR基因分型、免疫荧光染色观察蛋白表达与共定位、蛋白质印迹（Western Blot）分析关键蛋白表达水平、ATP含量检测、细胞活力检测，以及改良神经严重程度评分（mNSS）和莫里斯水迷宫（MWM）等行为学测试来评估神经功能与认知恢复情况。

星形胶质细胞PKM2基因缺失对他莫昔芬给药后的影响

为了特异性敲除星形胶质细胞中的PKM2基因，研究人员使用了Aldh1l1-CreERT2; PKM2^f/f小鼠模型，并通过连续5天注射他莫昔芬进行诱导。

PCR基因分型证实了Cre重组酶介导的PKM2基因floxed等位基因的成功删除。免疫荧光分析显示，与他莫昔芬处理后的PKM2^f/f对照组小鼠相比，Aldh1l1-CreERT2; PKM2^f/f实验组小鼠海马区星形胶质细胞（GFAP阳性）中PKM2的表达强度显著降低了约66.1%，PKM2与GFAP的共定位程度也降低了约65.7%。这一结果成功验证了星形胶质细胞特异性PKM2基因敲除模型的有效性。

乳酸补充对原代神经元培养物划痕愈合的影响

为了探究乳酸对损伤神经元的直接作用，研究团队在原代培养的神经元中进行了划痕实验，并在划痕后向培养基中添加乳酸。

培养24小时后，与仅使用溶媒的划痕组相比，乳酸处理组的划痕面积和宽度均显著减小（分别减少约36%和35%）。同时，乳酸处理显著提高了划痕后神经元的细胞活力（增加约45%）。免疫荧光分析进一步显示，乳酸处理增强了神经元内负责乳酸利用的关键蛋白——单羧酸转运蛋白2（MCT2）和LDHB的表达。这些体外实验结果表明，外源性乳酸补充能够有效促进损伤神经元的修复并提升其存活率。

PKM2基因缺失对TBI后神经元死亡和ATP水平的影响

在成功构建星形胶质细胞PKM2基因敲除小鼠模型后，研究人员进一步探究了该基因缺失对TBI后脑组织的影响。通过Fluoro-Jade B（FJB）染色标记退化神经元，发现与TBI诱导的PKM2^f/f对照组相比，TBI诱导的Aldh1l1-CreERT2; PKM2^f/f敲除组小鼠海马CA1区和齿状回（DG）区的FJB阳性神经元数量显著增加（CA1区增加约73%，DG区增加约92%）。

更重要的是，海马组织的ATP浓度测定显示，PKM2敲除组在TBI后的ATP水平比对照组显著降低了约33%。这些结果直接证明，星形胶质细胞PKM2的缺失会加剧TBI引起的海马神经元死亡和能量耗竭。

星形胶质细胞条件性PKM2基因缺失加重TBI后微管破坏和活性氧

研究进一步评估了PKM2缺失对神经元结构和氧化应激水平的影响。通过微管相关蛋白2（MAP2）染色评估神经元细胞骨架的完整性，发现TBI后，PKM2敲除组海马CA1区和DG区的MAP2荧光强度和面积百分比均显著低于对照组，表明微管结构破坏更为严重。同时，作为脂质过氧化和活性氧（ROS）水平标志物的4-羟基壬烯酸（4HNE）染色显示，PKM2敲除组在TBI后海马CA1和DG区的4HNE荧光强度显著高于对照组，表明氧化损伤加剧。这些发现提示，PKM2缺失不仅导致能量危机，还破坏了神经元的细胞骨架稳定性并加剧了氧化应激，共同推动了神经元走向死亡。

PKM2基因缺失对TBI后乳酸通路的影响

为了深入探讨其分子机制，研究人员分析了ANLS通路中关键分子的变化。免疫荧光共定位分析显示，与对照组相比，TBI后PKM2敲除组星形胶质细胞（GFAP阳性）中LDHA的表达显著降低，神经元（NeuN阳性）中LDHB的表达也明显减少。

蛋白质印迹结果进一步表明，PKM2敲除组海马组织中星形胶质细胞的乳酸转运蛋白MCT4，以及PKM2的相互作用蛋白P-STAT3和HIF-1α的表达水平均显著下调。这些结果综合表明，星形胶质细胞PKM2的缺失破坏了TBI后ANLS的正常运行，具体表现为乳酸生成（LDHA）、乳酸转运（MCT4）及其上游调控信号（P-STAT3/HIF-1α）的全面减弱，最终导致神经元无法获得足够的乳酸作为能源。

乳酸给药减轻PKM2基因缺失小鼠TBI诱导的神经元死亡

基于上述发现，研究团队提出了一个潜在的补救措施：外源性补充乳酸。他们在诱导TBI后，立即给PKM2基因敲除小鼠和野生型（WT）小鼠注射乳酸钠。

结果显示，乳酸治疗显著减少了PKM2敲除组小鼠海马CA1区和DG区的神经元死亡（分别减少约69%和64%）。在神经行为学评估中，乳酸治疗显著改善了PKM2敲除小鼠的改良神经严重程度评分（mNSS）和莫里斯水迷宫（MWM）测试表现，促进了神经功能和认知能力的恢复。此外，NeuN染色表明，乳酸治疗还显著增加了PKM2敲除小鼠海马CA1区的存活神经元数量。这些结果有力地证明，外源性乳酸补充能够绕过因PKM2缺失而受损的ANLS，直接为神经元提供能量底物，从而发挥神经保护作用。

本研究通过严谨的实验设计，系统地阐明了星形胶质细胞PKM2在TBI后神经元能量代谢和存活中的核心地位。研究结论强调，PKM2通过调控P-STAT3/HIF-1α信号轴，影响LDHA和MCT4的表达，从而主导ANLS功能，为神经元提供必需的乳酸燃料。当TBI发生时，星形胶质细胞PKM2的缺失会严重破坏这一精密的代谢协作，引发神经元能量衰竭、氧化应激和结构损伤，最终导致广泛的神经元死亡和认知功能障碍。而外源性乳酸补充作为一种替代能源策略，能够有效补偿ANLS的功能不足，显著减轻神经损伤并促进功能恢复。这项工作不仅深化了我们对TBI病理生理机制，特别是脑细胞间代谢对话的理解，更重要的是，它将星形胶质细胞的PKM2确立为一个潜在的治疗靶点，并验证了乳酸补充作为一种简单而有效的代谢干预策略的可行性，为开发针对TBI及其他神经系统疾病的新疗法提供了重要的理论依据和实验支持。