基于神经元来源细胞外囊泡神经丝轻链鉴别帕金森病与伴静止性震颤的特发性震颤的探索性研究

《Molecular Neurobiology》：Neurofilament Light Chain from Neuronally Derived Extracellular Vesicles in Differentiating Parkinson’s Disease from Essential Tremor with Resting Tremor

本研究针对帕金森病(PD)与伴静止性震颤的特发性震颤(rET)临床鉴别诊断困难的问题，开展了基于神经元来源细胞外囊泡(NDEVs)中神经丝轻链(Nf-L)水平的生物标志物研究。结果显示PD患者NDEV Nf-L水平显著高于rET患者和健康对照(HC)，在区分PD与rET时曲线下面积(AUC)达0.902，表明NDEV Nf-L可作为血液来源的生物标志物辅助临床鉴别诊断。

　　

在老年人群中，震颤障碍是最常见的运动障碍之一，其中帕金森病(Parkinson's disease, PD)和特发性震颤(essential tremor, ET)尤为常见。尽管这两种疾病在病理机制上存在本质区别——PD以黑质致密部多巴胺能神经元丢失和路易体形成为特征，而ET主要与小脑浦肯野细胞丢失和形态改变相关，但它们在临床表现上却存在显著重叠。特别是约18%的ET患者会出现静止性震颤(resting tremor)，被称为伴静止性震颤的特发性震颤(rET)，其症状与PD的静止性震颤极为相似，这为临床鉴别诊断带来了巨大挑战。

目前，区分PD与rET的金标准是¹²³I-ioflupane单光子发射计算机断层扫描(DaTscan)，但这种方法具有侵入性、费用高昂且耗时较长。因此，开发易于获取、非侵入性且标准化的分子血液生物标志物成为临床实践的迫切需求。

神经丝轻链(neurofilament light chain, Nf-L)作为神经轴索损伤的标志物，在帕金森综合征的体液生物标志物研究中备受关注。然而，在ET中的研究结果却存在矛盾。近年来，神经元来源细胞外囊泡(neuronally derived extracellular vesicles, NDEVs)作为一种能够反映亲代细胞状态的新型生物标志物载体展现出独特优势。这些由神经元释放的微小囊泡可以穿过血脑屏障，通过针对神经元蛋白L1CAM的免疫捕获技术能够从血液中有效分离，为中枢神经系统病理过程提供更精确的信息。

在这项发表于《Molecular Neurobiology》的研究中，意大利研究团队首次探讨了NDEV Nf-L在区分PD与rET中的诊断价值。研究纳入了33例PD患者、13例rET患者和30名健康对照(HC)。通过尺寸排阻色谱和L1CAM免疫捕获技术从血清中分离NDEVs，并采用Ella自动化ELISA平台定量Nf-L水平。

研究的关键技术方法包括：通过尺寸排阻色谱和免疫亲和捕获技术分离血清中的NDEVs；使用可调电阻脉冲传感技术和透射电子显微镜对细胞外囊泡进行表征；采用Western blotting和流式细胞术验证NDEVs的标志物表达；通过自动化免疫分析平台定量NDEV Nf-L浓度。

NDEVs的特征验证

研究人员首先对分离的细胞外囊泡进行了全面表征。可调电阻脉冲传感技术显示获得的纳米颗粒主要尺寸在150纳米以下，透射电子显微镜确认这些颗粒具有30-150纳米的直径范围、球形形态和脂质双分子层结构，符合国际细胞外囊泡学会(MISEV2018)定义的"小细胞外囊泡"标准。

Western blotting分析进一步证实了NDEVs的富集效果，在所有研究组中均检测到四跨膜蛋白(CD63、CD9、CD81)和神经元标志物L1CAM的表达。使用正常IgG作为捕获抗体的流式细胞术分析未检测到细胞外囊泡，证明了L1CAM免疫捕获的特异性。

NDEV Nf-L的浓度差异

在所有受试者中，外周NDEVs的蛋白裂解液均检测到Nf-L。统计分析显示，PD患者的NDEV Nf-L浓度显著高于rET患者和健康对照。具体而言，PD与rET之间的差异具有统计学意义(p=0.001)，PD与HC之间的差异极为显著(p<0.0001)。而rET患者与HC之间的NDEV Nf-L水平则基本重叠(p=0.62)，没有显著差异。

相关性分析发现，在rET患者中，NDEV Nf-L水平与性别存在显著关联，女性患者中的水平较高(p=0.01)。而在PD患者和健康对照中，未发现NDEV Nf-L与人口统计学或临床特征之间的显著关联。

诊断性能评估

接收者操作特征曲线分析显示，NDEV Nf-L在区分PD与HC时表现出极佳的诊断性能，曲线下面积(AUC)为0.987，灵敏度达93.9%，特异性为96.7%。在区分PD与rET时，NDEV Nf-L同样表现出优秀的鉴别能力，AUC为0.902，灵敏度为84.8%，特异性为84.6%。

研究结论与讨论部分指出，这是首次在NDEVs中评估Nf-L水平以区分PD与rET的研究。结果表明，PD患者NDEV Nf-L水平显著升高，而rET患者与健康对照无显著差异，这为两种疾病的鉴别诊断提供了有价值的血液生物标志物。

从病理机制角度，Nf-L作为髓鞘化轴突中主要表达的神经元胞质蛋白，在神经轴索损伤时会被释放到脑脊液和血液中。本研究发现在rET中NDEV Nf-L水平与健康对照相当，可能表明rET的神经元损伤相对有限，或者小脑变性不与Nf-L释放相关。然而，考虑到其他小脑变性疾病如脊髓小脑性共济失调中外周Nf-L水平升高的事实，支持前一种假设的可能性更大。

与既往研究相比，本研究的创新点在于首次在神经元特异性细胞外囊泡而非总细胞外囊泡群体中评估Nf-L。此前两项在PD中研究细胞外囊泡Nf-L的工作未发现患者与对照间的差异，但那些研究是在总细胞外囊泡群体中进行的，忽略了细胞来源的特异性。本研究通过L1CAM免疫捕获特异性富集神经元来源的细胞外囊泡，提供了更准确反映中枢神经系统病理状态的信息。

研究的优势包括：所有患者均经过DaTscan验证诊断，极大降低了误诊风险；严格遵循国际诊断标准；对细胞外囊泡进行了全面表征。同时，研究也存在一些局限性：rET患者样本量较小，这是由于该综合征相对罕见所致；缺乏神经病理学确诊；横断面设计无法评估NDEV Nf-L对疾病进展的预测价值；L1CAM的特异性存在一定争议，因为它也在多种神经元和非神经元细胞中表达。

值得注意的是，ET患者发展为PD的风险比普通人群高4-5倍，因此未来需要纵向研究来评估NDEV Nf-L在预测rET患者发展为PD中的潜在价值。研究人员也承认，本次探索性分析未包含Nf-L检测方法的技术验证和线性数据，未来研究将按照FDA/EMA指南进行完整的分析验证。

总之，这项初步研究表明，NDEV Nf-L能够准确区分PD与rET，作为一种易于获取的血液生物标志物，在临床鉴别诊断中具有重要应用前景。未来需要在更大规模、多中心的研究中验证这些发现，并纳入临床相关的疾病对照（如多系统萎缩、进行性核上性麻痹等），以进一步确认其临床实用价值。