灵长类ASPM基因敲除导致严重小头畸形与脑内少突胶质细胞缺失

《Protein & Cell》：Primate ASPM knockout causes severe microcephaly and oligodendrocyte loss in the brain

本研究针对ASPM突变在灵长类脑发育中的机制空白，通过CRISPR/Cas9技术构建食蟹猴ASPM双外显子敲除模型，发现其引发脑重量减少超70%、少突胶质细胞特异性缺失及神经元成熟障碍，首次揭示ASPM在灵长类髓鞘形成及皮质扩张中的关键作用，为研究人类小头畸形病理机制提供了更贴近临床的大型动物模型。

　　

在人类大脑发育的复杂过程中，脑皮质扩张和沟回形成是灵长类独特的重要特征，而神经发生和胶质发生是驱动这一过程的核心机制。其中，ASPM（异常纺锤体样小头畸形相关）基因的突变是导致原发性遗传性小头畸形（MCPH）最常见的原因。尽管在小鼠等啮齿类动物中ASPM敲除仅引起轻度脑体积减小（4-12%），人类患者却表现为皮质体积减少超过50%，这种显著差异提示ASPM的功能可能存在物种特异性。更为关键的是，小鼠等模型动物缺乏灵长类特有的脑皮质沟回结构和外层脑室下区（oSVZ），而该区域在灵长类胶质发生和脑扩张中扮演着关键角色。因此，利用在脑结构上更接近人类的非人灵长类模型来研究ASPM的功能，对于揭示人类小头畸形的发病机制具有不可替代的价值。

为了填补这一研究空白，由李夏江和郭翔宇共同通讯的研究团队在《Protein & Cell》上发表了他们的最新研究成果。研究人员选择食蟹猴作为实验对象，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术，同时靶向ASPM基因的第3和第9外显子，旨在构建一个可能完全敲除所有ASPM蛋白亚型的灵长类动物模型。研究团队将编辑工具注射到受精卵中，经过胚胎移植，最终获得了6只活产猴子。通过对这些新生猴的基因型分析，他们发现其中一只雄性猴子为ASPM纯合敲除（KO），而其余五只则可能为杂合或嵌合体，且表型正常。研究焦点随之集中在这只唯一的ASPM KO猴子及其基因匹配的对照猴上。

主要关键技术方法

本研究的关键技术包括：利用CRISPR/Cas9系统靶向食蟹猴ASPM基因的外显子3和9以构建敲除模型；通过胎盘或脑组织样本进行T7E1酶切 assay和BsmAI酶切 assay进行基因编辑效率验证；采用免疫组织化学染色、Western blotting蛋白印迹分析以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据挖掘来评估脑组织病理变化、蛋白表达及细胞类型特异性。

ASPM KO猴表现出严重的生长缺陷和脑发育异常

与同龄对照猴相比，ASPM KO猴从出生起就表现出明显的头围和体重偏小。这种生长迟缓的表象在3、6、9个月时持续存在。不幸的是，该KO猴在9月龄时因肺炎死亡，限制了更长期的行为学观察。尸检结果显示，ASPM KO猴的全脑重量仅为对照猴的28.4%，身体重量为对照的62.8%，表明脑部发育受损远比身体发育受损更为严重。对前额叶皮质（PFC）的解剖切片直观显示，KO猴的皮质厚度显著变薄。免疫组化染色证实其脑内ASPM蛋白表达完全缺失。DNA测序进一步揭示了外显子3存在多种移码突变（如2 bp插入、5 bp缺失和246 bp缺失），外显子9存在9 bp缺失，这些突变均预期导致蛋白质翻译提前终止。

皮质结构保留但神经元成熟受阻

尽管ASPM KO猴的皮质灰质变薄，其六层皮质结构仍然得以保留。然而，在高倍镜下观察神经元标志物NeuN的染色发现，KO猴皮质中NeuN阳性细胞的密度增加，且具有长神经突的细胞数量减少。Western blotting分析显示，代表新生神经元的标志蛋白双皮质素（DCX）在KO猴脑组织中表达升高，这暗示ASPM的缺失导致了神经元成熟过程的障碍。

少突胶质细胞特异性缺失及其下游影响

本研究最显著的发现之一是少突胶质细胞的显著减少。通过对单细胞RNA测序数据的分析，研究人员注意到ASPM在非人灵长类的少突胶质细胞中也有表达。免疫染色结果明确显示，少突胶质细胞谱系标志物Olig2阳性的细胞在KO猴脑白质区域密度急剧下降，而星形胶质细胞和小胶质细胞则未发生明显变化。定量分析证实了少突胶质细胞密度的降低和神经元密度的相对增加。与此一致，由少突胶质细胞产生的髓鞘相关蛋白，如髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）以及Olig2蛋白本身，在Western blotting中的表达量均显著下降。鉴于髓鞘形成对于维持神经元突触功能至关重要，研究人员进一步检测了突触相关蛋白，发现突触后密度蛋白95（PSD95）、突触素（synaptophysin）、突触体相关蛋白25（SNAP25）和微管相关蛋白2（MAP2）在ASPM KO猴脑中同样减少，表明髓鞘缺失可能间接导致了突触发育的异常。

研究结论与意义

本研究发现，与ASPM敲除小鼠的轻度表型和雪貂模型20-40%的脑重减少相比，ASPM双外显子敲除的食蟹猴呈现出极为严重的小头畸形（脑重减少超过70%），并且首次在动物模型中揭示了少突胶质细胞的特异性缺失。研究人员推测，这种严重的表型可能源于其独特的基因编辑策略：同时靶向两个外显子（第3和第9外显子）很可能彻底消除了所有已知的ASPM蛋白亚型的表达，从而实现了完全的功能丧失。ASPM作为一种中心体蛋白，对细胞有丝分裂纺锤体的正常形成至关重要。其功能完全丧失很可能破坏了少突胶质细胞前体细胞（OPC）的增殖和分化。在灵长类脑中，少突胶质细胞的生成对于脑皮质扩张至关重要，特别是在啮齿类中缺乏的外层脑室下区（oSVZ），该区域是灵长类胶质发生和沟回形成的关键区域。因此，少突胶质细胞的特异性缺陷可能是导致灵长类ASPM敲除后出现远比啮齿类严重的小头畸形的核心原因。这项研究不仅强调了ASPM在灵长类脑发育，特别是在少突胶质细胞生成和髓鞘形成中的关键作用，也凸显了非人灵长类模型在模拟人类神经发育障碍方面的独特优势。尽管本研究因仅获得一例纯合子KO猴而存在样本量的局限，但它为理解ASPM相关小头畸形的病理机制提供了全新的视角，并指出少突胶质细胞功能障碍可能是未来干预治疗的一个重要靶点。