利用多路复用微型化双光子显微镜实现的高速神经成像

《Cell Reports Methods》：High-speed neural imaging with multiplexed miniaturized two-photon microscopy

双光子显微镜通过光束多路化策略显著提升成像速度和吞吐量，支持大视野多平面钙成像（16.5 Hz）及群体电压成像（400 Hz），并发现神经活动在社交和听觉刺激下的差异。

　　在神经科学领域，对神经活动进行高分辨率、高通量的实时观测是一项极具挑战性的任务。传统的双光子显微镜在固定动物的实验条件下已经取得了重要进展，但其在自由活动动物中的应用仍面临速度和通量的限制。特别是对于需要高帧率（数百Hz）的电压成像和大体积多平面钙离子成像，当前的双光子微型显微镜在这些方面存在明显的不足。为了克服这些限制，研究人员开发了一种名为M-MINI2P的新型双光子微型显微镜，通过光束复用技术显著提高了成像速度和通量，同时保持了高空间分辨率和大视野（FOV）。这种创新性的设备为研究自由活动小鼠的神经活动提供了更强大的工具，能够捕捉神经元在自然行为状态下的快速动态变化。

M-MINI2P的创新之处在于其采用的光束复用方法，分为时间复用（TM-MINI2P）和计算复用（CM-MINI2P）两种模式。在时间复用模式中，通过在不同时间点将激光脉冲分配到两个不同的FOV，然后在数据采集时利用时间门控技术进行信号分离。这种方法能够在不降低空间分辨率的前提下，将成像速度提升至原来的一倍。而在计算复用模式中，通过使用约束非负矩阵分解（CNMF）算法，在采集时将两个重叠的FOV信号进行计算分离，从而实现更高效的成像。两种方法都基于相同的光学布局，但各自采用了不同的光学配置和信号处理策略，以适应不同的实验需求。

在自由活动的小鼠中，M-MINI2P系统被用于对视觉皮层（V1）和前额叶皮层（PFC）的钙离子成像。研究显示，该设备能够在500 × 500 μm2的FOV中实现多平面成像，单平面帧率可达81.5 Hz。同时，M-MINI2P系统也能够实现电压成像，帧率达到了400 Hz，FOV为380 × 150 μm2，这使得研究人员能够在自由活动的小鼠中对大量神经元进行高通量的实时观测。这些成像技术不仅能够捕捉神经元在自然行为状态下的活动，还能够研究其在不同环境下的反应差异。

通过在自由活动小鼠中进行社会行为和听觉刺激实验，研究人员发现，M-MINI2P系统能够有效区分不同行为条件下神经元的活动模式。例如，在社会行为实验中，某些神经元在与另一只小鼠互动时表现出更高的活动水平，而在孤立状态下则相对较低。此外，在听觉刺激实验中，研究人员发现，某些神经元在固定头条件下和自由活动条件下对声音的反应存在显著差异，这表明实验条件对神经活动的记录具有重要影响。这些发现不仅揭示了神经网络在不同行为状态下的动态变化，还为研究神经活动与行为之间的关系提供了新的视角。

M-MINI2P系统的优势在于其能够同时处理多个FOV的数据，而不会显著影响小鼠的自由活动。通过优化光路设计和信号处理算法，该设备能够在保持高空间分辨率的同时，实现更高的成像速度。此外，该设备的重量控制在3克以下，能够有效减少对小鼠自然行为的干扰。在实验中，研究人员还发现，使用M-MINI2P系统记录的神经活动数据在运动轨迹和速度方面与未使用该设备的小鼠没有显著差异，这表明该设备对小鼠的行为没有明显影响。

在技术实现上，M-MINI2P系统采用了先进的光束复用策略，通过使用两个光纤将激光脉冲分别输送到不同的FOV，从而实现并行成像。这种方法不仅提高了成像速度，还增加了数据采集的通量。同时，研究人员还开发了专门的信号处理算法，如CNMF，以有效分离并提取不同FOV的神经活动信号。这些算法能够处理复杂的信号重叠问题，确保数据的准确性和可靠性。

在实验设计方面，研究人员使用了多种方法来验证M-MINI2P系统的性能。例如，通过比较使用和未使用该设备的小鼠的运动轨迹和速度，确认了其对动物行为的无干扰性。此外，通过使用深度学习算法（如DeepLabCut）对小鼠的运动进行分析，进一步验证了系统的可靠性。这些实验不仅展示了M-MINI2P系统的优越性能，还为未来的神经科学研究提供了重要的技术支持。

M-MINI2P系统的开发不仅提升了双光子显微镜的性能，还为神经科学领域带来了新的研究工具。该系统能够记录自由活动小鼠的大体积神经活动，为研究神经网络在自然行为状态下的动态变化提供了可能。同时，该设备的开放性设计也使得其他研究团队能够方便地进行改进和扩展，推动了该领域的进一步发展。

尽管M-MINI2P系统在提高成像速度和通量方面取得了显著进展，但仍存在一些局限性。例如，在时间复用模式中，由于荧光寿命和检测器响应的限制，仍然存在轻微的信号串扰。此外，在计算复用模式中，需要对单个FOV进行校准，这可能会增加实验的复杂性。未来的研究可能会进一步优化这些技术，以提高系统的性能和适用性。

总的来说，M-MINI2P系统代表了双光子显微镜技术的一项重要进步，为研究自由活动小鼠的神经活动提供了新的可能性。通过结合先进的光学设计和信号处理算法，该设备能够实现高通量、高分辨率的神经活动记录，为理解神经网络在自然行为状态下的功能提供了有力的工具。