过氧化物酶体-线粒体互作失调通过脂代谢紊乱和神经肌肉接头退化加速骨骼肌衰老

《Nature Communications》：Alterations in peroxisome-mitochondria interplay in skeletal muscle accelerate muscle dysfunction

本研究为解决衰老相关骨骼肌功能障碍的机制问题，开展了肌肉特异性Pex5敲除模型研究，发现过氧化物酶体功能障碍导致脂代谢异常（VLCFA累积和plasmalogen减少）、线粒体结构和功能损伤（cristae减少和OCR下降），并诱发神经肌肉接头（NMJ）退化和肌肉萎缩，揭示了维持过氧化物酶体功能对延缓肌肉衰老的重要意义。

　　

骨骼肌作为人体最大的组织，占体重的40-50%，不仅是维持全身能量代谢和葡萄糖脂质平衡的核心器官，更是蛋白质储备的重要仓库。然而，在衰老、癌症、糖尿病和肥胖等病理状态下，骨骼肌常出现进行性萎缩和功能下降，严重影响生活质量和生存率。尽管近年来对肌肉质量调控通路的理解有所深入，但针对肌肉萎缩的有效治疗方法仍显匮乏，这很大程度上源于对肌肉萎缩机制认识的不足。

过氧化物酶体（peroxisome）作为动态代谢细胞器，在脂质代谢和活性氧（ROS）清除中扮演关键角色。它通过脂肪酸氧化（尤其是极长链脂肪酸VLCFA）、醚脂（如plasmalogen）合成以及活性氧解毒等过程维持细胞稳态。与线粒体类似，过氧化物酶体也通过膜接触位点（MCS）、线粒体衍生囊泡和生物信使（如ROS或脂质）与其他细胞器（尤其是线粒体）紧密互动。然而，过氧化物酶体在骨骼肌中的具体功能及其与线粒体的交互作用仍不明确。

为了阐明这一问题，研究人员构建了肌肉特异性过氧化物酶体生物发生因子5（Pex5）敲除小鼠模型。Pex5是过氧化物酶体基质蛋白导入的关键受体，其突变会导致过氧化物酶体生物发生障碍（PBD），又称Zellweger谱系疾病。患者常表现为严重的肌张力低下、呼吸困难和肌肉萎缩，但肌肉组织中的具体病理机制尚未完全揭示。

本研究通过肌肉特异性敲除Pex5，发现小鼠虽出生正常、体重增长与对照组无差异，但过氧化物酶体蛋白导入功能严重受损，残留的PMP70阳性结构成为缺乏基质酶的“过氧化物酶体幽灵”（peroxisomal ghosts）。这些结构无法正常降解，pexophagy（过氧化物酶体自噬）流也显著减弱。

脂质组学分析显示，3月龄敲除肌肉中醚脂（包括PC[P]、PE[P]、PC[O]和PE[O]）水平下降，而含VLCFA的磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和甘油三酯（TG）增加， Cardiolipin（CL）总水平降低且链长趋向更长、不饱和度更高。这些变化与PBD患者成纤维细胞的脂质谱相似，表明过氧化物酶体功能缺失导致脂代谢紊乱。

随后，研究人员观察到线粒体形态和功能的进行性损害。3月龄时，线粒体嵴数量已减少；9月龄时，线粒体内容（mtDNA和 citrate synthase活性）下降，自噬流增强，但线粒体生物生成关键调节因子PGC1α和PGC1β蛋白水平降低；18月龄时，线粒体出现肿胀、嵴结构破坏，耗氧率（OCR）和呼吸链复合体活性下降，抗氧化酶（SOD1、SOD2、catalase）表达下调。这些结果表明，线粒体功能障碍随年龄增长而加剧。

此外，氨基酸代谢亦发生紊乱。3月龄敲除肌肉中谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸等游离氨基酸水平升高，而精氨酸和赖氨酸减少，这种代谢特征与不健康衰老相似。

在功能层面，3月龄敲除小鼠已出现肌力下降和运动耐力减弱（跑步距离减少30%），但此时尚未发生肌肉萎缩。到9月龄时，肌纤维横截面积分布开始偏移，萎缩相关基因（如MuRF1、Atrogin1、FoxO3、FoxO4、Bnip3）以及内质网应激相关基因（GADD34、XBP1）上调；18月龄时，肌肉萎缩明显，并出现肌纤维中心核、管状聚集物（tubular aggregates）和Z线蛋白（如α-actinin和MyoZ）降解。值得注意的是，研究人员发现新型F-box E3泛素连接酶Fbxl22在衰老肌肉中表达上调，且受FoxO转录因子调控，可能促进肌节蛋白降解。

更引人注目的是，Pex5缺失还导致神经肌肉接头（NMJ）退化。18月龄敲除肌肉中，神经细胞黏附分子（NCAM）表达升高，NMJ部分或完全去神经支配的比例增加，表明过氧化物酶体功能对维持神经肌肉交流至关重要。

在正常衰老过程中，肌肉过氧化物酶体含量也逐渐减少。研究人员发现，对照组小鼠在18月龄时Pex5、PMP70和MFP2蛋白水平下降，过氧化物酶体数量减少；26月龄时（衰老阶段），这些变化更加显著，且伴有肌力和肌肉质量下降。这表明过氧化物酶体减少可能是肌肉衰老的早期事件。

本研究综合运用了肌肉特异性基因敲除小鼠模型、RNA测序（RNA-seq）、非靶向和靶向脂质组学、高分辨率显微镜（STED和电子显微镜）、线粒体功能分析（Seahorse OCR和呼吸链复合体活性测定）、免疫印迹、免疫组化、运动耐力测试和肌力测量等技术方法。样本来源包括小鼠胫骨前肌（TA）、腓肠肌（GNM）、伸趾长肌（EDL）和屈趾短肌（FDB），并使用了AAV9病毒介导的基因传递和电穿孔转染技术。

Fig. 1 | Pex5缺失导致过氧化物酶体组装、蛋白导入和pexophagy流受损

通过STED显微镜观察，敲除肌肉中PMP70阳性斑点数量略有增加但无统计学差异，而过氧化物酶体尺寸显著增大且异质性增强。GFP-SKL转染实验显示，对照组中GFP呈点状分布（正常导入），而敲除组中GFP呈胞质弥漫（导入缺陷）。免疫共染色证实PMP70与catalase、ACAA1在对照组中共定位，而在敲除组中这种共定位减少。Western blot显示，结肠霉素（colchicine）处理后对照组PMP70和Pex16积累，表明pexophagy流活跃，而敲除组积累不明显，说明pexophagy流受损。

Fig. 2 | Pex5缺失肌肉的脂质组学特征改变

火山图显示3月龄敲除肌肉中多种脂质显著变化。醚脂（PC[P]和PE[P]）总浓度降低，而含VLCFA的PC、PE和TG增加。Cardiolipin总水平在3月龄降低，但18月龄时因对照组下降而无显著差异。Cardiolipin链长趋向更长（>C72）且不饱和度增加。

Fig. 3 | Pex5缺失导致线粒体内容进行性下降

RNA-seq分析显示，9月和18月龄敲除肌肉中线粒体呼吸、脂肪酸氧化和能量生成相关基因下调。mtDNA拷贝数和 citrate synthase活性在9月龄开始下降，18月龄进一步降低。电镜定量显示线粒体数量从9月龄开始减少。mt-Keima测定表明9月龄时线粒体自噬流增强。PGC1α/β蛋白水平在9月和18月龄均下降。

Fig. 4 | 线粒体超微结构和功能进行性改变

电镜显示，3月龄敲除肌肉线粒体嵴数量减少；9月龄时间歇性出现肿胀和嵴结构破坏；18月龄时线粒体面积和长宽比增加。OCR测定表明，基础呼吸、ATP关联呼吸和最大呼吸在9月和18月龄逐渐下降。呼吸链复合体活性（以citrate synthase归一化）仅在18月龄显著降低。抗氧化酶基因表达在3月龄（catalase）、9月龄（SOD1、SOD2）和18月龄（全部）下调。SPLICS PO-MT探针和STED显微镜显示，敲除肌肉和HEK293细胞中过氧化物酶体-线粒体接触点减少。

Fig. 5 | Pex5缺失导致早期肌力下降和后期肌肉萎缩

RNA-seq显示3月龄时肌原纤维组织、肌肉收缩和结构发育相关基因下调。代谢组学显示3月龄敲除肌肉中多种氨基酸积累。力-频率曲线和最大强直肌力在3月和18月龄均降低。纤维横截面积分析表明，3月龄无差异，9月龄时2500-3000μm2纤维减少，18月龄时1000-1500μm2纤维增加、3000-4000μm2纤维减少。萎缩相关基因在9月龄上调，Fbxl22 mRNA从9到18月龄逐渐增加。跑步耐力在3月龄和18月龄均下降。

Fig. 6 | Pex5缺失肌肉提前出现衰老相关肌病和NMJ退化

H&E染色显示9月和18月龄敲除肌肉中心核纤维增加。电镜显示18月龄敲除肌肉中出现管状聚集物。Gomori trichrome染色定量证实管状聚集物数量和面积增加。Western blot显示Z线蛋白（α-actinin和MyoZ）减少。NCAM免疫组化显示18月龄敲除肌肉中去神经纤维增加。NMJ免疫荧光显示敲除肌肉中完全和部分去神经支配比例增加。

Fig. 7 | 表型变化示意图

示意图总结了敲除模型中的主要发现：过氧化物酶体功能障碍导致脂代谢紊乱、线粒体嵴减少和运动能力下降，随后出现线粒体内容减少、功能受损，最终导致肌肉萎缩、管状聚集物积累、肌节降解和NMJ退化。

Fig. 8 | 正常衰老中过氧化物酶体含量逐渐下降

握力和纤维横截面积分析显示26月龄对照组小鼠出现肌力和肌肉质量下降。qPCR和Western blot显示过氧化物酶体生物发生（Pex5、Pex12）、β-氧化（ACOX1）和ROS解毒（catalase）相关基因和蛋白表达随年龄下降。STED显微镜显示过氧化物酶体数量在18月和26月龄减少。

本研究深入揭示了过氧化物酶体在维持骨骼肌健康中的核心作用。Pex5缺失导致过氧化物酶体蛋白导入缺陷、脂代谢紊乱（VLCFA累积和醚脂减少），进而引发线粒体嵴减少、内容下降和功能受损。这些变化最终导致肌力下降、肌肉萎缩和NMJ退化，加速肌肉衰老进程。值得注意的是，正常衰老肌肉中也观察到过氧化物酶体含量下降，表明过氧化物酶体功能障碍可能是衰老相关肌病的重要驱动因素。该研究不仅深化了对过氧化物酶体-线粒体互作的理解，也为开发针对肌肉萎缩和衰老的干预策略提供了新靶点。