《Microbial Pathogenesis》：Treponema pallidum protein Tp47 upregulates TNFAIP3 to promote microglia-mediated angiogenesis through the SOCS3/IL6 signaling pathway
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神经梅毒中Tp47蛋白通过调控TNFAIP3和SOCS3信号轴增强小胶质细胞迁移及IL6介导的内皮血管生成。
林谢|马凤倩|郑梦雪|严妍|王若颖|杨天慈|刘丽丽
厦门大学医学院中山医院临床实验室中心，中国厦门
摘要
背景
神经梅毒是由苍白密螺旋体（Treponema pallidum, T. pallidum）侵入中枢神经系统引起的，其特征是神经炎症和异常的血管生成。研究表明，T. pallidum 的 Tp47 蛋白能够调节小胶质细胞的功能，但其在中枢神经血管重塑中的具体作用仍有待阐明。
方法
为了探讨 Tp47 介导的神经血管相互作用，我们使用了人小胶质细胞克隆 3（HMC3）和人脐带血管内皮细胞（HUVECs）进行 Transwell 实验和条件培养基检测，以评估小胶质细胞的迁移能力和内皮管形成。通过化学发光免疫测定法测量细胞因子水平，并通过 Western blot 验证 RNA 测序鉴定出的关键炎症介质。使用特异性 siRNA 在 HMC3 细胞中敲低肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 3（TNFAIP3），并在 HUVECs 接触小胶质细胞条件培养基、重组 IL6 或针对 Tp47 或 IL6 的中和抗体后评估其血管生成特性。
结果
Tp47 显著增强了 HMC3 向 HUVECs 的迁移，并促进了内皮网络的形成。细胞因子分析和 RNA-seq 分析表明，IL6 和 TNFAIP3 是 Tp47 诱导的小胶质细胞炎症反应的核心。Tp47 上调了 TNFAIP3 的表达，后者抑制了细胞因子信号抑制因子 3（SOCS3），从而导致 IL6 分泌增加。敲低 TNFAIP3 可以恢复 SOCS3 的水平，减少 IL6 的产生，并减弱小胶质细胞条件培养基的促血管生成活性。中和 Tp47 或 IL6 可以抑制血管生成，而单独使用外源性 IL6 则可以再现这一效应。
结论
T. pallidum 的 Tp47 蛋白通过上调 TNFAIP3 和抑制 SOCS3 促进 IL6 驱动的血管生成，从而将小胶质细胞的炎症与神经梅毒中的神经血管变化联系起来。
引言
梅毒是由苍白密螺旋体（T. pallidum）引起的一种全身性感染，其特征是血管炎、病理性血管生成以及淋巴细胞和浆细胞的血管周围浸润[1]。当中枢神经系统（CNS）受到感染时，这些血管机制可能会持续存在，并导致神经梅毒的发展，包括损害视神经功能的脉络膜血管异常[2]。阐明 T. pallidum 在 CNS 内诱导炎症和血管生成反应的机制对于更好地理解梅毒的病理生理学以及开发预防神经梅毒和视神经病变等并发症的策略至关重要。
在参与梅毒发病机制的各种 T. pallidum 蛋白中，Tp47 因其强免疫原性和调节宿主免疫反应的能力而受到特别关注[3],[4],[5],[6]。我们之前的研究发现，Tp47 可以调节人小胶质细胞克隆 3（HMC3）的迁移和吞噬活性，表明其在中枢神经系统免疫调节中可能发挥作用[7],[8]。然而，它对血管重塑和炎症驱动的血管生成的贡献仍大部分未被探索，需要进一步研究。
新兴证据表明小胶质细胞参与血管生成[9],[10]。在缺乏巨噬细胞集落刺激因子的小鼠中，发育中的视网膜血管复杂性降低与小胶质细胞减少相关，这表明这些细胞具有调节作用[11]。在感染或炎症刺激下，小胶质细胞会进入不同的激活状态，并通过细胞因子、生长因子和细胞外囊泡的释放来影响血管重塑。肿瘤坏死因子 α 诱导蛋白 3（TNFAIP3）是小胶质细胞炎症的一个关键调节因子，这是一种在许多其他细胞类型中表达的 NFκB 依赖性基因[12],[13]。TNFAIP3 编码一种泛素编辑酶，可在 IL1β、TNF、IL6、CD40 和脂多糖等刺激下终止 NFκB 的激活[14],[15],[16]。TNFAIP3 是否通过改变小胶质细胞的细胞因子分泌间接控制内皮血管生成仍有待确定。
最近的研究表明，TNFAIP3 可以负调控细胞因子信号抑制因子 3（SOCS3）[17]。SOCS3 通过 IL6/STAT3 途径被诱导，从而抑制 IL6 信号通路[18]。当 SOCS3 被下调时，由于失去了这种抑制作用，IL6 信号通路会被增强。由于 IL6 直接刺激内皮细胞的增殖和迁移，并在肿瘤微环境中促进血管生成[18]，因此 SOCS3 在血管生成信号通路中占据关键调节位置。基于此，我们提出 Tp47 可以在小胶质细胞中诱导 TNFAIP3 的表达，从而导致 SOCS3 的抑制。由此产生的 IL6 产生和信号增强可能驱动小胶质细胞介导的血管生成。
重组 T. pallidum 蛋白 Tp47 的制备
重组全长 Tp47（1-434 个氨基酸，UniProt P29723.2）由 Boson Biotech Co., Ltd.（中国厦门）生产并纯化。具体操作如下：将 Tp47 编码序列克隆到 pQE-30 载体中，生成 N 端带有 His 标签的构建体，并在 lac 操作子控制下在大肠杆菌 M15 细胞中表达，得到可溶性的重组 Tp47（约 47 kDa），并通过 Ni 亲和层析纯化。纯化后，将 Tp47 与多粘菌素 B（100 mg/mL）以 1000:1 的比例在冰上孵育 2 小时以去除杂质。
T. pallidum 蛋白 Tp47 增强了 HMC3 细胞向人脐带血管内皮细胞（HUVECs）的迁移并促进了血管生成
小胶质细胞会对病原体或大脑稳态的紊乱作出反应，向损伤部位或血管结构迁移。为了研究与 HMC3 细胞迁移高度相关的 T. pallidum 蛋白 Tp47 是否也能增强它们向 HUVECs 的迁移，我们采用了 Transwell 共培养系统（图 1A）。共培养 24 小时后，Transwell 膜下方的迁移 HMC3 细胞以及下腔中的 HUVECs 被染色。
讨论
炎症在中枢神经系统中驱动血管生成，并在多发性硬化症、胶质瘤、癫痫和中风等疾病中促进疾病进展[21]。神经梅毒的特点是神经炎症[22]，这可以通过脑脊液中升高的炎症细胞因子水平以及与之相关的小胶质细胞激活得到证实[23]。先前的研究表明，T. pallidum 蛋白（如 FlaB3）可以诱导 HMC3 细胞分泌 IL6 和 CXCL8[24]。在本研究中，我们证明了 Tp47 也具有类似作用。
作者贡献声明
林谢：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学设计、实验实施、概念构思。
马凤倩：软件应用、实验实施。
郑梦雪：实验实施。
严妍：软件应用、方法学设计。
王若颖：方法学设计、实验实施。
杨天慈：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、概念构思。
刘丽丽：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。
利益冲突声明
所有作者均无需要披露的利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究的所有数据均包含在正文和补充材料中，如有需要，可向相应作者索取。
资助声明
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号 82271387、82272370）、福建省自然科学基金重点项目（编号 2022J02055）、福建省卫生健康创新项目（编号 2024CXB017）以及厦门市医疗卫生重点项目（编号 3502Z20234004）的支持。
竞争利益声明
? 作者声明没有已知的竞争利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了厦门大学医学院中山医院的支持。作者感谢所有参与者的贡献。
