CRISPR/Cas9介导的基因组编辑研究发现，10个在睾丸中表达丰富的基因以及1个在睾丸中表达不丰富的基因对小鼠的繁殖能力并非必需

《Andrology》：CRISPR/Cas9-mediated Genome-editing Reveals 10 Testis-enriched Genes and One Non-testis-enriched Gene are Dispensable for Male Fecundity in Mice

本研究通过CRISPR/Cas9技术敲除11个候选基因（10个睾丸富集基因及1个非富集基因），评估其对小鼠精子生成及生育能力的影响。结果显示，所有基因敲除小鼠均保持正常生育能力及精子形态与运动功能，提示这些基因可能并非精子生成必需。分隔符

　　本研究聚焦于男性生殖功能中可能发挥关键作用的基因，通过构建基因敲除（KO）小鼠模型，系统性地评估这些基因是否在维持正常生育能力方面具有不可或缺性。近年来，随着基因编辑技术的快速发展，特别是CRISPR/Cas9系统的广泛应用，科学家们能够更高效地生成特定基因缺失的小鼠，从而深入探究这些基因在生殖过程中的具体功能。在人类睾丸中，已有超过1000个基因被鉴定为高表达，这些基因可能在精子生成和功能中扮演重要角色。由于人类与小鼠基因的高度保守性，使用KO小鼠模型来研究这些基因在男性生育中的作用，成为一种标准且可靠的方法。

在本研究中，我们选取了11个可能与男性生殖相关的基因，其中包括10个睾丸特异性高表达的基因和1个非睾丸特异性表达的基因。通过CRISPR/Cas9系统，我们逐一构建了这些基因的KO小鼠模型，并对其生育能力和表型进行了详细分析。结果显示，所有KO小鼠在自然交配测试中均表现出正常的生育能力，且在睾丸外观、体重、组织学结构、精子形态和运动性等方面均无明显异常。这一结果表明，这些基因在小鼠的男性生殖系统中并非必需，即它们的缺失并未导致生育能力的显著下降。这一发现为理解睾丸特异性基因在男性生殖中的功能提供了重要线索，并有助于筛选那些在生殖过程中发挥核心作用的基因。

### 男性生殖功能的复杂性与基因作用的多样性

男性生殖功能是一个高度复杂且协调的过程，涉及多个阶段的连续性变化。首先，精子发生始于睾丸中的精原细胞，它们通过有丝分裂不断增殖，为精子生成提供原始细胞来源。随后，精母细胞进入减数分裂阶段，形成初级精母细胞和次级精母细胞，最终生成精子细胞。最后，精子细胞经历形态学分化，逐渐转变为成熟的精子。这一过程的任何一个环节受到干扰，都可能导致男性不育。因此，识别在精子发生和功能中起关键作用的基因，对于理解男性不育的分子机制具有重要意义。

在过去的几年中，研究人员已经发现了一些在精子生成过程中起关键作用的基因，例如TSKS、SPATA33和CCDC188，这些基因被证实是精子形成所必需的。此外，NICOL和NELL2在附睾中对精子成熟过程至关重要，而IZUMO1和TMEM81则在精子与卵子的结合过程中发挥关键作用。然而，也有研究指出，许多睾丸特异性基因在男性生育中并非不可或缺，其他基因可能通过功能补偿机制维持生殖系统的正常运作。这种基因之间的功能冗余现象，使得在小鼠模型中，某些基因的缺失并未导致明显的不育表型，这可能与物种间的基因功能差异或基因表达的灵活性有关。

### 基因筛选与KO小鼠模型的构建

为了更全面地了解睾丸特异性基因在男性生殖中的作用，我们从公共数据库中筛选出11个潜在的候选基因，其中包括10个睾丸特异性高表达的基因和1个在多个组织中表达的非睾丸特异性基因。这些基因的选择基于其在睾丸组织中的表达水平和可能的生物学功能。例如，一些基因可能在精子形成过程中起辅助作用，而另一些可能在精子成熟或功能中发挥重要作用。

构建这些基因的KO小鼠模型是本研究的核心步骤。我们使用CRISPR/Cas9系统设计了特异性引导RNA（gRNA），以靶向并去除这些基因的大部分或全部编码序列。为了确保基因编辑的准确性，我们借助CRISPRdirect软件优化gRNA设计，以减少脱靶效应的可能性。随后，我们将合成的crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白组合成Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物，并将其电穿孔至受精卵中。经过胚胎移植和发育后，我们通过PCR和Sanger测序对新生小鼠进行了基因型分析，以确认目标基因的缺失。

在构建KO小鼠模型的过程中，我们观察到不同基因的编辑效率存在差异，这可能与基因的结构、序列特异性以及实验操作的精确性有关。例如，某些基因可能由于其编码区域的复杂性或重复性，导致编辑效率较低，而另一些基因则由于其编码区域较为简单，编辑成功率较高。此外，我们还注意到，不同基因的缺失对小鼠表型的影响也存在差异，这可能与这些基因在生殖过程中的具体功能相关。

### KO小鼠的表型分析与生育能力评估

为了评估这些基因缺失对男性生育能力的影响，我们进行了自然交配实验。实验中，每只KO小鼠与三只野生型（WT）雌鼠共同饲养，并在交配期结束后移除雄鼠，继续饲养雌鼠以统计最终的产仔数量。结果显示，所有KO小鼠的产仔数量均与WT小鼠相当，表明它们在自然交配条件下仍能正常生育。这一结果进一步支持了这些基因在小鼠的男性生殖系统中并非必需的结论。

除了生育能力的评估，我们还对KO小鼠的睾丸形态、组织结构和精子特性进行了详细分析。首先，我们通过肉眼观察和称重，确认了KO小鼠的睾丸外观和重量与WT小鼠无明显差异。接着，我们对睾丸和附睾组织进行了组织学分析，发现KO小鼠的组织结构与WT小鼠相似，未出现明显的病理变化。此外，我们还检测了精子的形态和运动性，发现KO小鼠的精子形态和运动参数与WT小鼠基本一致，这表明这些基因的缺失并未影响精子的形成或功能。

### 基因功能的物种特异性与功能补偿机制

尽管所有KO小鼠在生育能力和表型上均表现出正常性，但这一结果并不意味着这些基因在人类中完全不重要。事实上，某些基因在小鼠中可能并非必需，但在人类中却可能发挥关键作用。例如，ATP6V1E2在小鼠中缺失并未影响生育能力，但在人类中，其表达水平与体外受精（IVF）和单精子显微注射（ICSI）的成功率密切相关。这一现象可能与物种间的基因功能差异或功能补偿机制有关。

在小鼠中，某些基因可能通过与其他基因的功能协同作用来维持生殖系统的正常运作。例如，ATP6V1E2属于V-ATPase复合物的一部分，该复合物在精子酸化过程中起关键作用。然而，V-ATPase由多个亚基组成，包括ATP6V1A到ATP6V1H，这些亚基可能在功能上相互补偿，从而使得ATP6V1E2的缺失未对小鼠的生育能力产生明显影响。类似地，PRDX6和PRDX6B属于同一蛋白家族，它们在精子中的表达和功能可能存在一定的重叠，从而在单个基因缺失的情况下，仍能维持正常的精子运动性和功能。

### 研究的意义与未来方向

本研究的结果表明，尽管这些基因在小鼠中并非必需，但它们在人类中的潜在作用仍值得进一步探索。由于目前尚无能够体外生成功能完整精子的系统，因此构建KO小鼠模型仍然是研究基因在男性生殖中功能的金标准。通过这种方式，我们可以更系统地了解基因在精子发生、成熟和功能中的具体作用，为相关疾病的机制研究和治疗策略提供理论依据。

此外，本研究的结果也有助于优化基因功能研究的资源分配。由于某些基因在小鼠中并非必需，因此在进行基因功能研究时，可以优先关注那些在KO模型中表现出显著表型变化的基因。这不仅能够提高研究的效率，还能减少对非关键基因的重复研究，从而推动对男性生殖功能核心调控机制的深入理解。

未来的研究可以进一步探索这些基因在人类中的具体作用，尤其是在与生殖障碍相关的疾病中。例如，某些基因的表达水平可能与男性不育的发病率相关，而它们的缺失是否会导致特定的生育缺陷仍需进一步验证。此外，研究这些基因在不同物种间的功能差异，有助于揭示其在进化过程中的适应性变化，从而为基因治疗和生殖医学提供新的思路。

总之，本研究通过构建KO小鼠模型，系统评估了11个可能与男性生殖相关的基因在小鼠中的功能，发现这些基因在小鼠中并非全部关键。这一结果不仅为理解男性生殖系统的基因调控网络提供了新的视角，也为后续研究指明了方向，即应更加关注那些在KO模型中表现出显著功能变化的基因，以深入探索其在生殖过程中的具体作用。