RepFluo：一种基于熔解曲线分析的快速体外荧光检测方法，用于评估Cas9的活性

《ACS Omega》：RepFluo, a Fast Fluorescent In Vitro Assay of Cas9 Activity Exploiting Melting Curve Analysis

提出基于熔解曲线分析（MCA）的快速、低成本且高通量的体外CRISPR/Cas9活性检测方法，利用SpyCas9和sgRNA切割报告DNA后，通过SYBR Green I或荧光淬灭系统分析熔解温度变化，并开发了配套的R语言分析工具包。

　　CRISPR/Cas系统自问世以来，因其在基因编辑领域的广泛应用而受到广泛关注。其中，Cas9作为最常被研究的CRISPR相关核酸酶，其在体外反应中的活性评估对于开发新的诊断工具和优化实验条件至关重要。然而，传统的体外检测方法往往依赖于复杂的设备或耗时的步骤，限制了其在大规模实验中的应用。因此，研究者们正在探索更快速、简便且高通量的检测手段，以满足不断增长的需求。本文介绍了一种基于熔解曲线分析（Melting Curve Analysis, MCA）的新型体外检测方法，用于评估Cas9蛋白的活性，为CRISPR技术在诊断领域的应用提供了新的可能性。

该方法的核心假设是，Cas9切割DNA后，所产生的短片段具有比未切割DNA更低的熔解温度。通过熔解曲线分析，可以观察到这些DNA片段在不同温度下的变化，并据此推断Cas9的切割效率。与传统的电泳分析相比，这种方法无需进行复杂的样品分离，而是通过热循环仪直接进行熔解曲线分析，从而显著简化了实验流程。此外，熔解曲线分析的读取时间仅为15分钟，大幅减少了实验耗时。这使得该方法在实际操作中更加高效，同时也降低了对实验设备和专业人员的要求，提升了实验的可及性和实用性。

为了实现这一目标，研究团队设计了两种不同的报告DNA（reporter DNA）：一种是基于荧光淬灭（Fluorophore-Quencher）的报告DNA，另一种是基于SYBR Green I染料的报告DNA。这两种报告DNA的设计均包含一个目标序列，用于检测Cas9的切割活性。在荧光淬灭报告DNA中，荧光基团和淬灭剂分别连接在非靶向链的两端，使得当DNA被切割后，荧光基团与淬灭剂之间的距离增加，从而降低荧光信号。而SYBR Green I报告DNA则通过染料与DNA的结合特性来检测熔解曲线的变化。两种方法都依赖于熔解曲线的形状和温度变化来判断Cas9是否成功切割目标DNA。

该方法的另一个关键优势在于其数据处理流程的优化。传统的熔解曲线分析通常依赖于商业软件，而本文提出了一种基于Gaussian混合模型（GMM）的自定义数据处理方法。通过将熔解曲线信号建模为多个高斯分布的叠加，研究团队能够更精确地计算出熔解曲线的变化，并将其转化为一个可以衡量Cas9活性的指标。这种方法不仅提高了数据处理的准确性，还使得不同实验之间的结果具有更好的可比性。此外，研究团队还开发了一个R语言的分析包，简化了整个数据处理过程，使得研究人员可以更轻松地应用这一方法。

为了验证该方法的可靠性，研究团队进行了多种实验。首先，他们测试了不同sgRNA（单导向RNA）对熔解曲线的影响，以确定是否能够区分靶向和非靶向反应。结果表明，使用靶向sgRNA的样品在熔解曲线中表现出明显的温度差异，而使用非靶向sgRNA的样品则没有显著变化，这证明了该方法对Cas9切割活性的检测具有高度的特异性。其次，研究团队还测试了不同温度对Cas9活性的影响，以确定熔解曲线分析是否能够有效终止反应。结果显示，在53.9°C左右的温度下，Cas9的活性可以被完全抑制，这表明熔解曲线分析能够作为终止反应的可靠手段。

此外，研究团队还评估了该方法在不同实验条件下的适用性。他们发现，该方法对于不同长度的报告DNA和不同的sgRNA设计都具有良好的适应性，且在多种实验条件下均能提供可靠的结果。为了进一步提高方法的准确性，他们引入了基线校正算法，以消除熔解曲线中可能存在的干扰信号。这一改进使得熔解曲线的分析更加精确，尤其是在处理具有肩部特征的曲线时，能够有效减少误差。

该方法的另一个重要特点是其对反应动力学的分析能力。通过在不同时间点终止反应，研究团队能够观察到Cas9切割DNA的速率，并将其建模为双指数方程。结果显示，SYBR Green I报告DNA的反应速率比荧光淬灭报告DNA更快，这可能与两种报告DNA的结构差异有关。这一发现不仅有助于优化实验条件，也为未来的研究提供了重要的参考。

总体而言，本文提出了一种基于熔解曲线分析的新型体外检测方法，能够快速、准确地评估Cas9蛋白的活性。该方法具有广泛的适用性，不仅适用于Cas9，还可能适用于其他CRISPR相关核酸酶甚至非CRISPR的核酸酶。其简便的操作流程、低成本的实验材料以及高度的可重复性，使其成为一种极具潜力的工具，尤其适用于高通量筛选和大规模实验。此外，研究团队还开发了一个开源的R分析包，进一步提升了该方法的可及性和实用性。这一方法的提出，不仅为CRISPR技术在诊断领域的应用提供了新的思路，也为相关领域的研究带来了重要的技术支持。