低水平的小胶质细胞活性与注意力缺陷/多动障碍模型大鼠的多动行为相关：一项使用肾上腺素能β2受体激动剂作为小胶质细胞激活剂的研究

《Glial Health Research》：Low microglial activity correlates with hyperactivity in attention deficit/hyperactivity disorder model rats: A study using an adrenergic β2 agonist as a microglia activator

β2受体激动剂 clenbuterol（CLB）通过增强前额叶皮层微胶质细胞的突触清除功能，抑制LHR大鼠过度活动，但对注意力缺乏无效。

　　微胶质细胞在神经发育障碍的发病机制中被认为发挥着重要作用。本研究探讨了微胶质细胞在列表氏大鼠（LHRs）中的作用，以及β2肾上腺素受体激动剂克伦特罗（CLB）对这些行为和微胶质细胞功能的影响。LHRs是一种非近交的非白化鼠种，因其表现出过度活跃、冲动和注意力不集中等行为特征，被广泛用作注意力缺陷/多动障碍（ADHD）的动物模型。研究发现，与八周龄的Wistar大鼠相比，相同年龄的LHRs中，前额叶皮层（mPFC）的微胶质细胞标志物和吞噬相关因子的表达水平较低。CLB是一种能够穿过血脑屏障的β2肾上腺素受体激动剂，它能够抑制脂多糖（LPS）诱导的微胶质细胞促炎激活。然而，在没有LPS的情况下，CLB增加了培养细胞中CD11b的表达，而去甲肾上腺素则会降低其表达。当CLB通过皮下注射给LHRs使用时，其前额叶皮层中的微胶质细胞大小以及CD11b和CD68蛋白表达均有所增加。此外，CLB还提高了编码CD68、C1qb和巨噬细胞表达基因1（mpeg1）的mRNA表达，这些基因可能与微胶质细胞的突触消除有关。CLB还降低了即刻早期基因（IEGs）和囊泡谷氨酸转运体1（VGLUT1）的mRNA表达。尽管CLB的给药减少了LHRs的过度活跃行为，但并未影响其注意力不集中行为。从CLB处理过的LHRs前额叶皮层中分离出的微胶质细胞含有更多的突触素1（Syn1）和谷氨酸能突触蛋白PSD95，而从对照组（车辆组）处理过的LHRs中分离出的微胶质细胞则较少。免疫印迹分析显示，LHRs的mPFC组织中cFos和PSD95的含量高于Wistar大鼠，而CLB的给药降低了这两种蛋白的表达水平。这些结果表明，微胶质细胞可能通过消除兴奋性突触来调节运动活动，且β2肾上腺素受体可能激活微胶质细胞的吞噬作用。

在神经发育障碍中，如自闭症谱系障碍（ASD）和ADHD，微胶质细胞的形态和功能发生了变化。在ASD中，微胶质细胞的突触吞噬功能可能受到一定程度的损害，导致成熟ASD模型动物中存在过多的突触。在ASD患者的尸检脑组织中，观察到微胶质细胞密度增加和形态异常（细胞体和突起增大），这表明微胶质细胞在吞噬突触方面的能力受损。激活的微胶质细胞引发的神经炎症反应被认为与ADHD的发病机制有关。在循环系统或脑脊液中，促炎细胞因子如IL-6和TNFα的水平升高已被报道。多巴胺D1样受体可以抑制微胶质细胞的促炎反应，而甲基苯丙胺（Methylphenidate）作为一种增强多巴胺能神经传递的药物，是ADHD的常用治疗药物。因此，微胶质细胞可能在ADHD的发病机制中起着重要作用。

LHRs作为一种新型的ADHD动物模型，因其表现出过度活跃、冲动和注意力不集中等行为特征，以及对非刺激性ADHD药物如阿托莫西汀（Atomoxetine）的反应性而受到关注。LHRs比传统使用的自发性高血压大鼠（SHRs）表现出更强的过度活跃和注意力不集中行为。在LHRs的mPFC中发现了增加的神经元活动和缩短的轴突起始段。本研究发现，LHRs的mPFC中微胶质细胞的密度较低，细胞大小也较小，这表明增强微胶质细胞的活性可能有助于改善ADHD行为。微胶质细胞长期以来被认为表达肾上腺素受体（ARs），其中β2AR在微胶质细胞中最为丰富，并介导去甲肾上腺素（NA）对这些细胞的抑制和激活作用。β2AR激动剂通过防止NFκB向细胞核转移来抑制LPS诱导的促炎介质的表达。此外，β2AR还对微胶质细胞的活性和形态产生抑制作用。然而，关于β2AR或NA对微胶质细胞的激活作用，存在不同的观点，这可能是在某些条件下由其他类型的AR介导的。

本研究显示，能够穿过血脑屏障的β2AR激动剂CLB通过上调微胶质细胞CD11b的表达增强了微胶质细胞的突触消除，从而抑制了过度活跃行为，但未影响注意力不集中行为。虽然CLB在麻醉动物中已被证明会减少微胶质细胞的分支和监视活动，但本研究显示，CLB在没有LPS的情况下增加了CD11b等吞噬相关因子的表达，同时抑制了LPS诱导的促炎激活。此外，CLB还增加了脑内CD68的表达。在对LHRs前额叶皮层中微胶质细胞进行的免疫细胞化学染色中，发现CLB处理组的微胶质细胞内部化了更多的Syn1和PSD95蛋白，而未影响内部化的parvalbumin蛋白，这表明CLB增强了谷氨酸能突触的消除，而非GABA能突触。接下来，研究者通过检测cFos和PSD95蛋白的表达变化来探讨CLB是否降低了mPFC中的神经元活动。虽然变化幅度较小，但CLB确实降低了cFos和PSD95蛋白的表达水平。

最后，研究者评估了CLB对LHRs的ADHD样行为的影响。在开放场测试（OFT）中，未接受CLB的LHRs表现出频繁进入中心区域和长时间停留在中心区域的行为，这表明其过度活跃和冲动行为。而CLB的给药减少了这些行为，同时β2AR特异性拮抗剂ICI逆转了CLB对运动活动的影响。连续四天的OFT结果显示，未接受CLB的LHRs每天在开放场中表现出增加的活动，这与ADHD患者在相同环境中的行为特征相似。CLB的给药抑制了这种活动的增加。此外，通过跌落测试评估注意力不集中行为，发现CLB并未阻止LHRs从木盘上跌落，这表明CLB主要抑制了过度活跃和冲动行为，而非注意力不集中行为。

LHRs的mPFC中神经元活动增加已被不同方法所证实，与Wistar大鼠相比，Syn1蛋白在LHRs的mPFC中更为丰富。在断奶后将LHRs置于丰富环境中可以降低其过度活跃行为，并且IEG如Fos、Egr1和Arc的表达水平降低至与Wistar大鼠相当的水平。这些结果表明，增加的突触数量（可能主要是谷氨酸能突触）可能是导致过度活跃的原因。微胶质细胞的低吞噬活性至少部分导致了神经元活动的增强，从而引发过度活跃行为。因此，微胶质细胞的突触吞噬可能在调节整体运动活动方面发挥作用。

CSF1或巨噬细胞集落刺激因子对微胶质细胞的发育和生存至关重要，CSF1受体的抑制剂已被广泛用于消除小鼠脑中的微胶质细胞。在LHRs的脑中观察到CSF1R表达减少。这种减少可能与微胶质细胞活性和密度的降低有关。尽管大多数研究指出，微胶质细胞的缺乏不会在啮齿类动物中引起明显的行为变化，但一些研究表明，在胚胎或幼年阶段短暂消除微胶质细胞会导致动物表现出过度活跃和减少焦虑样行为。因此，微胶质细胞活性的降低可能在发育过程中导致过度活跃和镇静效果。然而，微胶质细胞活性在未成熟脑中的降低是否会导致成熟脑中神经元活动的增加和兴奋性神经传递的增强，仍需进一步研究。

本研究显示，β2AR激动剂CLB能够改善LHRs的过度活跃行为。然而，这并不意味着BBB穿透性的β2AR激动剂可以用于ADHD的临床治疗。事实上，Ryan等人的研究表明，每日给药21天的低剂量CLB（0.03 mg/kg，腹腔注射，每日两次）并未对Sprague-Dawley大鼠的运动活动产生抑制作用，尽管在急性阶段其运动活动有所减少。因此，本研究强调了微胶质细胞在调节运动活动中的可能作用。

本研究的一个局限性是，虽然我们通过体外和体内实验显示了ICI对CLB作用的逆转，但CLB的作用是否仅通过β2AR介导仍未完全阐明。通过在微胶质细胞中条件性删除β2AR，可以进一步验证CLB通过β2AR的具体作用。此外，虽然已有研究指出男性和女性微胶质细胞的形态和功能存在差异，但本研究中仅使用了雄性大鼠进行体内实验。因此，研究结果可能仅适用于雄性大鼠。事实上，雄性和雌性ADHD病例表现出不同的症状，雌性病例中过度活跃行为不如雄性明显，而更可能表现出注意力不集中症状。

研究过程中，所有动物实验均在 Ehime 大学动物实验伦理委员会的批准和指导下进行（批准编号：05U40-16）。Wistar 大鼠（CLEA Japan，东京，日本）和 LHRs（Kyudo， Tosu，日本）均在本实验室内繁殖。本研究中仅使用雄性大鼠（8-9周龄）。大鼠在恒温（25°C）的动物设施中饲养，采用12小时明暗循环（早上7点开启灯光，晚上7点关闭灯光），每笼饲养4只大鼠，自由获取食物和水。

在体内实验中，CLB由Sigma-Aldrich（东京，日本）购买，溶解在生理盐水（0.5ml）中，每天皮下注射一次，剂量范围为0-0.5 mg/kg体重。使用相同体积的车辆或生理盐水作为对照。ICI-118551（Cayman Chemical Company；MI，美国）溶解在生理盐水中，每天与CLB（0.06 mg/kg体重）混合后皮下注射。药物给药后5小时进行脑组织解剖和行为测试。

在体外实验中，CLB和NA（Sigma-Aldrich）在0.01至10 μM之间添加到大鼠原代微胶质细胞培养中。ICI溶解在生理盐水中，以10 μM的浓度与1 μM CLB同时加入培养基中。细胞在加入药物后6小时被收集用于流式细胞术分析。

定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）用于分析脑组织和原代培养微胶质细胞的基因表达。总RNA从脑组织和原代培养的微胶质细胞中提取，使用Maxwell RSC simplyRNA Tissue/Cells Kit（Promega，Madison，WI，美国）。cDNA使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with a gDNA remover kit（Toyobo，大阪，日本）合成。qPCR在MJ Mini仪器（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）上进行，使用THUNDERBIRD? Next SYBR? qPCR Mix（Toyobo）。所有PCR引物序列列于补充表1（Hokkaido System Science Co., Ltd., Sapporo, Japan）。qPCR数据以Gapdh或Actb的表达百分比表示，计算公式为100 × 1/2^(Ct of target gene – Ct of GAPDH gene)（Islam et al., 2018）。Gapdh和Actb的表达水平以Ct值表示。

大鼠原代微胶质细胞培养方法如前所述（Tanaka et al., 1999）。新生大鼠的皮层细胞被机械解离，培养11天后，在聚-L-赖氨酸包被的培养皿中进行培养。通过摇晃培养皿并利用细胞在聚苯乙烯皿上附着的特性，从培养皿中分离出微胶质细胞，并进行纯化。对于药理学研究，纯化的微胶质细胞在加入药物后6小时被收集用于流式细胞术分析。

流式细胞术（FCM）和流式细胞分选（FACS）用于分析微胶质细胞的表型。Wistar大鼠和LHRs的前额叶皮层（经或未经药理学处理）使用gentleMACS dissociator（Miltenyi Biotec，东京，日本）和成人脑解离试剂盒（Miltenyi Biotec）进行解离。制备的细胞悬液用于FCM和FACS分析。对于多色免疫荧光标记，细胞在冰上与抗CD32抗体（Rat BD Fc Block；BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，美国）孵育20分钟以阻断Fc受体。随后，细胞与荧光标记的抗体（针对细胞表面抗原CD11b和CD45）在4°C下孵育30分钟，使用BioLegend（San Diego，CA，美国）的抗体。FCM使用APC标记的CD11b和Pacific Blue标记的CD45。FACS分析使用APC标记的CD11b和PE标记的CD45。标记后的细胞使用CytoFLEX S（Beckman Coulter，东京，日本）进行FCM分析。使用Zombie dyes（BioLegend）对死细胞进行门控，通过绘制前向散射参数（高度 vs. 面积）对单细胞进行门控。门控时使用阴性对照荧光，即每个抗体的对照。分析数据使用FlowJo软件（版本10.9；Treestar，Ashland，OR，美国）进行进一步处理。对于FACS，标记后的细胞在4°C下使用细胞盖（AL ANACYTE，Hamburg，德国）保存，直到进行分选。使用FACS Aria III（BD Biosciences）对CD11b+的微胶质细胞进行分选，并随后进行免疫印迹分析。为了检测CD68，细胞在BD Cytofix/Cytoperm?溶液中固定和通透化，按照制造商的说明（BD Biosciences）进行操作，并重新分析。

微胶质细胞的免疫组织化学染色方法如前所述（Abe et al., 2018）。大鼠在4%多聚甲醛（Wako）中灌注10分钟。取出的脑组织在15%蔗糖（PBS）中浸泡两周。经蔗糖处理的脑组织进行冷冻切片，厚度为16 μm，并使用针对CD11b的抗体（Gene Tex，San Antonio，TX，美国）进行免疫组织化学染色。使用TBSt（Takara Bio，Kyoto，日本）和阻断剂（Blocking One，Nacalai Tesque，Inc.，Kyoto，日本）进行洗涤。使用山羊抗小鼠Cy3标记的二抗（Jackson ImmunoResearch Labs，West Grove，PA，美国）进行染色。Hoechst 33342（Merck，Darmstadt，德国）用于核染色。免疫染色样本使用Prolong Gold抗褪色试剂（Thermo Fisher Scientific，东京，日本）进行封片。使用全功能荧光显微镜BZ-X800（Keyence，大阪，日本）进行成像，并使用混合细胞计数软件（Keyence）进行细胞计数。

分选的微胶质细胞进行免疫细胞化学染色，方法如前所述（Dissing-Olesen et al., 2023）。大鼠的成年脑组织被解离为单个细胞，如上所述。CD11b+的细胞通过磁珠分选（CD11b MicroBeads，Miltenyi Biotec）和FACS两种方式进行分选。通过磁珠分选获得的细胞使用BD Cytofix/Cytoperm?溶液（BD Biosciences）进行固定和通透化。通过FACS获得的细胞悬浮于E2培养基中，并铺在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上，放置在4孔塑料板（Sigma-Aldrich）中。随后，细胞使用4%多聚甲醛进行固定，如前所述（Ishii et al., 2015，Mori et al., 2002）。对于免疫细胞化学染色，细胞与针对CD11b（GeneTex）和PSD95（Cell Signaling，Danvers，MA，美国）的抗体孵育，随后与Hoechst 33342（Merck）和二抗（Jackson Immuno Research Labs）进行孵育，其中小鼠IgG标记为Cy3，兔IgG标记为Alexa Fluor 488。细胞在荧光显微镜（BZ-X800）下进行观察。

行为测试部分，开放场测试（OFT）用于评估大鼠的运动行为。大鼠被单独释放到一个100 × 100 cm的开放场装置中，该装置有50 cm高的墙壁，使用视频追踪系统（Ethovision XT 14；Noldus Info. Tech. (Wageningen, The Netherlands)）记录其行为。测量的参数包括总移动距离、移动持续时间、首次进入中心区域的延迟时间以及在中心区域的停留时间。开放场装置中心的光照强度为62 lx。

跌落测试用于评估大鼠的注意力不集中行为。具体操作为，将每只大鼠放置在一个直径15 cm、距地面40 cm的黑暗涂漆木盘上，观察其在5分钟内的运动情况。大多数大鼠从木盘上跌落，这表明跌落是由注意力不集中而非冲动引起的。因此，CLB的给药改善了LHRs的过度活跃行为，但并未影响其注意力不集中行为。

本研究的结果表明，微胶质细胞可能通过消除兴奋性突触来调节运动活动，而β2肾上腺素受体可能激活微胶质细胞的吞噬作用。研究还发现，CLB的给药在体外和体内均能增强微胶质细胞的吞噬活性，特别是在没有LPS的情况下。这些发现为进一步研究微胶质细胞在ADHD中的作用提供了新的视角。同时，研究也指出，尽管CLB能够改善ADHD样行为，但其临床应用仍需谨慎，因为其对运动活动的抑制作用可能并不持久。此外，研究还强调了微胶质细胞在神经发育中的重要性，以及其活性变化可能对神经功能和行为表现产生的深远影响。