朝着一种集多种功能于一体的重组腺相关病毒载体迈进：利用CRISPR-Cas技术实现朊病毒基因的功能性敲除

《PLOS One》：Toward an all-in-one recombinant adeno-associated virus vector for functionally ablating the prion gene using CRISPR-Cas technology

功能性敲除Prnp基因的AAV载体设计与在鼠脑中的初步应用。研究构建了整合NCAM1启动子、SluCas9-HF内切酶及靶向gRNA的“all-in-one”AAV载体，通过荧光报告系统（TLR）验证基因编辑效率达20% (体外)和5% (体内)，并发现9P31 capsid载体经 retro-orbital途径注射后脑分布效率较PHP.eB提高7.5倍。

　　本研究围绕一种基于CRISPR-Cas系统的基因编辑策略展开，旨在通过腺相关病毒（AAV）载体实现对细胞型朊蛋白（PrP^C）基因的高效和持久抑制，从而探索其在朊病治疗中的潜力。朊病是一类迅速进展的致命神经退行性疾病，影响部分脊椎动物，并在人类中造成约每五千年一例的死亡率。该病的主要特征是PrP^C在细胞内形成富含β折叠的聚合物，称为PrP Scrapie（PrP^Sc），这些结构被认为与疾病发生密切相关。目前，对于朊病的治疗手段尚不成熟，且存在诸多挑战，例如药物难以穿透血脑屏障（BBB），且其作用效果具有暂时性。而基于病毒载体的基因治疗则为解决这些问题提供了新的可能性。

在本研究中，科学家们构建了一种新型的重组AAV（rAAV）载体，该载体编码了针对PrP基因的特定引导RNA（gRNA）和一种小型的Cas9内切酶。这种设计允许通过宿主细胞内的非同源末端连接（NHEJ）修复机制，实现对PrP基因的精准编辑，从而降低其表达水平。考虑到AAV载体的包装限制，研究团队选择了尺寸较小、具有高特异性、且对PAM序列要求较低的SluCas9-HF内切酶，以确保其在脑细胞中的有效表达。此外，为便于监测基因编辑效果，研究者还设计了一种“交通灯报告系统”（TLR），该系统通过红色和绿色荧光蛋白的表达状态，来指示是否成功地进行了PrP基因的编辑。

研究团队采用了一种可扩展的rAAV组装和纯化流程，以确保获得高质量的病毒载体。他们使用了带有NCAM1截断启动子的表达载体，该启动子在PrP^C表达细胞中具有较高的活性。这一选择基于对NCAM1与PrP基因在人类组织中高度相关的观察。通过这一策略，研究团队期望实现一种在脑细胞中特异性表达的基因编辑系统，从而在不影响正常细胞功能的前提下，有效降低PrP^C的水平。他们还开发了一种基于荧光标记的报告系统，用于追踪和评估基因编辑的效率，这为后续的临床前研究提供了重要的工具。

在体外实验中，研究团队验证了rAAV载体的表达能力，并发现其在人类细胞和小鼠细胞中均能有效降低PrP表达水平。对于体内实验，研究者通过立体定位注射和眼眶静脉注射两种方式将rAAV载体引入小鼠脑中。结果显示，使用9P31外壳的载体相较于传统的PHP.eB外壳，能够显著提高基因表达效率。这表明，选择合适的病毒外壳对于实现高效的脑部递送至关重要。此外，研究还发现，眼眶静脉注射相比立体定位注射，能够实现更广泛的脑部分布，这可能为未来更有效的基因治疗方案提供支持。

为了进一步评估该基因编辑策略的潜力，研究者使用了多种检测方法，包括免疫组织化学（IHC）、Western blot和下一代测序（NGS）。这些方法帮助研究人员确定了基因编辑对PrP表达水平的影响，并验证了TLR系统在监测编辑效果方面的可靠性。结果表明，rAAV载体在小鼠脑中能够有效降低PrP^C的表达，尽管目前的编辑效率仍相对较低，但这一结果为后续的优化研究奠定了基础。

然而，研究也指出了当前技术的一些局限性。例如，尽管9P31外壳能够显著提高基因表达水平，但其装载率仍然存在不足，这可能影响治疗效果。此外，基因编辑的持续性和稳定性也是需要进一步研究的问题。为了实现更持久的治疗效果，未来可能需要优化病毒载体的装载率，并探索更高效的基因编辑策略。同时，研究团队还提到，尽管CRISPR-Cas9系统在体外和小鼠模型中表现出良好的编辑能力，但在人类中的应用仍面临诸多挑战，包括免疫反应、递送效率和长期安全性等问题。

在讨论部分，研究者进一步探讨了该基因编辑策略的潜在影响。他们指出，虽然NHEJ修复机制可能导致非特异性编辑，但通过选择高特异性gRNA，可以最大限度地减少脱靶效应。此外，研究还提到，NHEJ修复可能导致mRNA的无意义剪切（NMD），从而减少PrP蛋白的表达。这种机制在朊病中可能具有保护作用，因为短的N端PrP片段可能无法正常折叠，进而被细胞质中的质量控制机制清除。然而，这种片段仍可能在某些情况下被分泌，从而影响疾病进程。

研究者还强调了AAV基因治疗在临床应用中的挑战。例如，尽管rAAV载体具有相对较低的免疫原性，但在某些情况下，它们仍可能引发免疫反应，影响后续治疗的效果。此外，AAV载体的生产成本较高，这可能限制其在临床试验中的广泛应用。然而，随着技术的进步和生产规模的扩大，这些成本有望在未来降低。

在结论部分，研究者指出，目前的研究仍处于初步阶段，尚未证明该基因编辑策略能够显著延长朊病小鼠的生存时间。虽然在小鼠模型中观察到了PrP表达的降低，但这种效果是否足以影响疾病进程仍需进一步验证。此外，由于人类脑组织的复杂性，将该策略应用于临床仍需解决许多关键问题，包括如何实现更广泛的基因递送、如何避免免疫反应以及如何确保基因编辑的长期稳定性。未来的研究可能会聚焦于这些方面，以推动该技术向临床应用迈进。

总体而言，这项研究为朊病的基因治疗提供了一个可行的框架，并展示了一种基于CRISPR-Cas9的策略。通过优化病毒载体的设计、外壳选择以及基因编辑效率，研究者希望实现一种能够有效降低PrP^C表达、从而延缓疾病进展的疗法。虽然目前的实验结果表明该方法具有一定的潜力，但进一步的研究仍需解决诸如装载率、免疫反应和临床转化等问题。随着相关技术的不断进步，这种基于AAV的基因编辑方法有望在未来成为治疗朊病的重要手段之一。