基于点击化学的RNA引导GFP可编程成像技术开发及其在活细胞RNA可视化中的应用

《Nucleic Acids Research》：Development of programmable RNA imaging with RNA-guided GFP via click chemistry

本研究针对活细胞RNA成像技术存在的遗传操作复杂、分子尺寸大、潜在干扰强等瓶颈，开发了一种新型RNA引导绿色荧光蛋白(RGG)平台。研究人员通过点击化学将DBCO修饰的向导RNA与叠氮化GFP高效偶联，实现了NEAT1和SatIII等核内RNA的可视化。该技术具有程序化设计、分子紧凑、无需基因改造等优势，为RNA动态研究提供了强大工具。

　　

在分子生物学研究领域，实现对细胞内RNA分子的精准定位和实时追踪一直是科学家们追求的目标。传统的RNA成像方法如荧光原位杂交(FISH)虽然灵敏度高，但需要固定细胞，只能获得静态图像。而广泛应用于活细胞成像的MS2-MCP系统，虽然能够动态追踪RNA，但需要在目标RNA中插入多个MS2茎环序列，这种遗传改造可能影响RNA的天然功能、结构或定位。近年来兴起的CRISPR-Cas13系统为RNA成像带来了新希望，但其依赖较大的蛋白质复合物和RNA-蛋白质相互作用，可能给多重成像带来挑战或引入潜在干扰。

面对这些技术瓶颈，日本大阪大学的研究团队另辟蹊径，从CRISPR系统的RNA引导机制中获得灵感，开发了一种全新的化学偶联策略。他们设想能否像CRISPR系统那样，利用向导核酸的序列特异性，但通过更简洁的化学方法直接将荧光蛋白引导至目标RNA？这种思路催生了RNA引导绿色荧光蛋白(RGG)平台的诞生，相关研究成果发表在《Nucleic Acids Research》上。

这项研究的核心创新在于将点击化学的高效性与RNA引导的精准性完美结合。团队采用应变促进的叠氮-炔环加成反应(SPAAC)，这是一种生物正交反应，不需要有毒的铜催化剂，在生理条件下也能高效进行。他们在GFP表面特定位点引入叠氮基团，同时合成末端修饰有二苯并环辛炔(DBCO)的向导RNA，两者通过SPAAC反应共价结合，形成具有靶向能力的RGG复合物。

研究人员为开展这项研究运用了几个关键技术方法：首先采用非天然氨基酸(UAA)插入技术，在GFP特定位点引入叠氮基团，为点击化学偶联提供反应位点；利用SPAAC点击化学反应实现DBCO修饰的核酸与叠氮化GFP的高效偶联；通过电穿孔技术将RGG复合物递送至哺乳动物细胞；建立NONO-mScarlet-I3和HSF1-mScarlet-I3报告细胞系作为核内RNA定位的标记系统；采用共聚焦显微镜进行活细胞成像分析；通过RNA免疫沉淀定量PCR(RIP-qPCR)验证RGG与靶标RNA的特异性结合。

Development of chemically conjugated DNA/RNA-protein complexes

研究团队成功构建了化学偶联的DNA/RNA-蛋白质复合物。通过系统优化，他们发现将p-叠氮甲基-L-苯丙氨酸(AmF)插入GFP第151位酪氨酸位点形成的151AmF-GFP，在与DBCO-RNA偶联时效率最高，达到73%。实验表明，RGG和DNA引导的GFP(DGG)复合物均能特异性结合单链RNA(ssRNA)，效率分别为88%和86%，但对双链DNA(dsDNA)没有结合能力，显示出对单链模板的特异性识别能力。

Intracellular NEAT1 RNA imaging with RGG

在活细胞成像实验中，研究人员发现仅3'-DBCO修饰的RNA向导能有效实现NEAT1成像，与核内标记蛋白NONO共定位。相比之下，DNA向导(DGG)和5'-DBCO修饰的RNA向导均未能特异性成像。RNA-FISH实验进一步证实RGG信号与NEAT1探针共定位，表明其直接靶向NEAT1长链非编码RNA。与FITC标记的RNA探针和dCas13b系统相比，RGG在共定位效率上表现更优，且不会形成dCas13b常见的蛋白聚集体。

Optimizing imaging efficiency of RGG

通过对向导RNA长度的系统优化，研究发现30核苷酸的DBCO-RNA在NEAT1成像中效果最佳。虽然尝试了多种化学修饰如硫代磷酸酯(PS)、2'-O-甲氧乙基(2'-MOE)等以提高核酸酶抗性，但这些修饰仅呈现改善趋势，未达统计学显著性。重要的是，未修饰的30nt DBCO-RNA已能有效实现NEAT1成像，表明该技术具有较好的鲁棒性。

Intracellular RNA targeting with RGG for SatIII RNA visualization in multiple cell lines

研究进一步验证了RGG平台在不同细胞系和不同靶标RNA中的应用潜力。针对应激诱导表达的SatIII RNA，研究人员在HEK293和HeLa细胞中均成功实现了特异性成像。RGG信号与热休克因子1(HSF1)标记共定位，且RNA-FISH和RIP-qPCR实验均证实了其靶向特异性。值得注意的是，RGG在递送后6小时即可检测到信号，但48小时后逐渐消失，这种瞬时性有助于减少脱靶效应的积累。

在讨论部分，作者深入分析了RGG技术的优势与局限。与CRISPR-dCas13系统(232kDa)相比，RGG(43kDa)分子量更小，更容易接近如NEAT1这类嵌入复杂核结构的RNA目标。其直接标记化学和紧凑尺寸使其成为难以接近RNA的理想成像工具。然而，研究也观察到胞质背景信号，可能源于未结合GFP-RGG探针的非特异性聚集，这是未来需要优化的方向。

该研究的创新性在于首次通过化学偶联方式构建了合成核酸-蛋白质复合物，为可编程核酸识别提供了新范式。RGG平台结合了CRISPR系统的程序化设计和点击化学的简洁高效，规避了遗传操作的需求，为RNA定位和功能研究提供了多功能工具。其模块化设计允许将GFP替换为其他功能蛋白，拓展了在RNA生物学、化学生物学和分子工程中的应用前景。

这项技术的重要意义在于它填补了现有RNA成像工具的技术空白，为研究核内RNA的动态分布、转录调控和功能机制提供了强大武器。随着进一步优化，RGG平台有望在疾病机制研究、药物开发和诊断治疗中发挥重要作用，推动RNA生物学研究进入新阶段。