CERS6通过稳定RPN1蛋白调控内质网应激促进食管鳞癌增殖的新机制与靶向治疗探索

《Cell Death Discovery》：CERS6 promotes esophageal squamous cell carcinoma proliferation by increasing the stability of RPN1

本研究针对食管鳞状细胞癌(ESCC)预后差、治疗手段有限的临床难题，深入探讨了神经酰胺合成酶6(CERS6)在ESCC中的致癌机制。研究人员发现CERS6通过其TLC结构域直接结合核糖体受体蛋白1(RPN1)，抑制其泛素化降解从而维持蛋白稳定性，进而激活HSPA5-IRE1-XBP1信号通路，降低内质网应激和活性氧(ROS)水平，最终促进ESCC增殖。尤为重要的是，研究证实靶向CERS6的反义寡核苷酸(ASO)能有效抑制肿瘤生长，为ESCC提供了新的治疗策略。

　　

食管癌是全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，其中食管鳞状细胞癌(ESCC)是最常见的病理类型。由于早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，传统的手术、放疗和化疗效果有限。尽管近年来分子靶向治疗和免疫治疗取得了一定进展，但ESCC患者的总体预后仍然较差。因此，深入探索ESCC发生发展的分子机制，寻找新的治疗靶点具有重要意义。

内质网应激(ER stress)和活性氧(ROS)在肿瘤发生发展中扮演着双重角色。一方面，适度的内质网应激和ROS水平可以促进肿瘤细胞适应恶劣环境；另一方面，过度的应激则会导致细胞凋亡。前期研究表明，调控内质网应激可能成为ESCC的治疗策略。神经酰胺合成酶6(CERS6)是内质网上的关键酶之一，主要负责合成C16-神经酰胺，参与鞘脂代谢途径。近年来研究发现CERS6在多种肿瘤中高表达，包括胰腺癌、胃癌、肺癌等，但其在ESCC中的具体功能和机制尚不清楚。

在这项发表于《Cell Death Discovery》的研究中，研究人员通过组织微阵列分析发现CERS6在ESCC组织中显著高表达，且与患者不良预后密切相关。进一步的功能实验表明，CERS6能够促进ESCC细胞在体外的增殖和克隆形成能力，以及在裸鼠体内的肿瘤生长。机制研究中，团队通过蛋白质pull-down联合质谱分析技术，意外地发现CERS6并非通过其经典的神经酰胺合成酶活性发挥作用，而是通过其Tram-Lag-CLN8(TLC)结构域直接结合RPN1蛋白，抑制由E3泛素连接酶ASB11介导的RPN1泛素化降解，从而维持RPN1蛋白稳定性。

RPN1是寡糖基转移酶(OST)复合物的关键组分，参与蛋白质N-糖基化过程。研究显示，CERS6-RPN1轴能够激活热休克蛋白家族A成员5(HSPA5)-肌醇需求酶1(IRE1)-X盒结合蛋白1(XBP1)信号通路，降低内质网应激和ROS水平，进而抑制ESCC细胞凋亡，促进肿瘤增殖。值得注意的是，研究人员设计了靶向CERS6的反义寡核苷酸(ASO)，在体外和体内实验中均证实能够有效抑制ESCC生长，这为ESCC的靶向治疗提供了新的思路。

研究采用的主要技术方法包括：组织微阵列免疫组化分析(59例ESCC患者样本)、细胞功能实验(MTT法、平板克隆形成、软琼脂克隆形成)、动物模型(细胞源性异种移植CDX和患者源性异种移植PDX模型)、蛋白质相互作用研究(pull-down结合质谱分析、免疫共沉淀Co-IP)、分子对接模拟、蛋白质稳定性检测(环己酰亚胺CHX追踪实验)、泛素化分析等。

高CERS6表达与ESCC预后负相关

通过免疫组化检测发现，CERS6在ESCC组织中的阳性百分比(85.58%)显著高于癌旁组织(44.39%)，且与患者较短的总生存期相关。TCGA数据库分析显示CERS6 mRNA在食管癌组织中明显上调，Western blot结果进一步证实CERS6蛋白在癌组织中高表达。

CERS6促进ESCC细胞体外和体内增殖

在七种ESCC细胞系中检测CERS6蛋白表达，发现KYSE150和KYSE450细胞高表达CERS6。通过CRISPR/Cas9技术敲除CERS6后，ESCC细胞的增殖能力、克隆形成能力和锚定非依赖性生长能力均显著抑制。过表达CERS6则能增强KYSE70细胞的增殖能力。动物实验进一步证实，敲除CERS6的KYSE150细胞在裸鼠体内形成的肿瘤体积和重量均明显减小。

CERS6与RPN1在ESCC细胞中结合

通过pull-down联合质谱分析筛选出36个与CERS6相互作用的候选蛋白，与BioGRID数据库交叉比对后鉴定出RPN1和SEC22B两个蛋白。进一步分析显示RPN1在食管癌中高表达且与不良预后相关，而SEC22B无此相关性。免疫荧光证实CERS6与RPN1在细胞质中共定位，Co-IP实验验证了二者的直接相互作用。分子对接预测和截短体实验表明CERS6通过其TLC结构域与RPN1结合。

CERS6通过稳定RPN1蛋白促进ESCC增殖

研究发现敲除CERS6可降低RPN1蛋白水平而不影响其mRNA表达，CHX追踪实验表明CERS6敲除加速了RPN1蛋白降解。蛋白酶体抑制剂MG132能逆转这一效应，说明RPN1主要通过泛素-蛋白酶体途径降解。泛素化实验显示CERS6能竞争性抑制ASB11介导的RPN1泛素化。功能挽救实验证实RPN1介导了CERS6的促增殖作用。

CERS6-RPN1轴通过HSPA5-IRE1-XBP1信号通路抑制ROS介导的凋亡

研究发现敲除CERS6可降低HSPA5、IRE1和XBP1蛋白表达，增加ROS水平和细胞凋亡。挽救RPN1表达能逆转这些效应，表明CERS6-RPN1轴通过调控内质网应激信号通路影响ESCC细胞存活。

靶向CERS6的ASO治疗抑制ESCC增殖

研究人员设计了两种靶向CERS6的ASO(ASO-581和ASO-1130)，体外实验表明ASO处理能显著降低CERS6表达，抑制ESCC细胞增殖，增加ROS水平和细胞凋亡。PDX模型进一步证实ASO治疗能有效抑制肿瘤生长，降低Ki67阳性率和RPN1-HSPA5-IRE1-XBP1通路蛋白表达。

本研究揭示了CERS6在ESCC中通过非经典机制发挥促癌作用的新模式。与传统认知不同，CERS6并非通过其神经酰胺合成酶活性，而是依靠TLC结构域直接结合并稳定RPN1蛋白，进而调控内质网应激信号通路。这一发现拓展了我们对CERS6功能多样性的理解，为ESCC的分子分型和靶向治疗提供了新的视角。

从转化医学角度看，靶向CERS6的ASO治疗在临床前研究中显示出良好的抗肿瘤效果，且作用机制明确，为开发ESCC靶向药物提供了实验依据。与传统的小分子抑制剂相比，ASO技术具有靶向特异性强、作用直接等优势，有望克服CERS6家族成员间高度同源带来的选择性难题。

值得注意的是，内质网应激调控在肿瘤治疗中具有双重性，适度激活可诱导肿瘤细胞凋亡，过度抑制则可能促进肿瘤生存。本研究通过阐明CERS6-RPN1-HSPA5-IRE1-XBP1信号轴的具体机制，为精准调控ESCC内质网应激提供了理论依据。未来研究可进一步探索该通路与其他内质网应激信号分支的crosstalk，以及在不同ESCC亚型中的特异性，推动个体化治疗策略的发展。

总体而言，该研究不仅揭示了CERS6在ESCC中的新功能机制，还验证了其作为治疗靶点的可行性，为改善ESCC患者预后提供了新的思路和实验证据。