神经元表面组织型纤溶酶原激活剂单链向双链转化的机制及其在神经发育与学习记忆中的调控作用

《Cell Death & Disease》：Neuronal conversion of single-chain tissue-type plasminogen activator into its two-chain form: implications in neurodevelopment, learning, and memory

本研究针对中枢神经系统中组织型纤溶酶原激活剂（tPA）单链（sc-tPA）与双链（tc-tPA）异构体功能差异的调控机制不明问题，通过荧光标记重组tPA及药理学手段，首次揭示成熟皮质神经元特异性通过纤溶酶原（Plg）-纤溶酶（Plasmin）级联反应将sc-tPA转化为tc-tPA，该过程依赖tPA的Kringle 2结构域且独立于纤溶酶原赖氨酸结合位点（LBS）。这一发现为理解tPA在神经可塑性、发育及疾病中的双向调控提供了新视角。

　　

在大脑的精密调控网络中，组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator, tPA）作为一种丝氨酸蛋白酶，远不止参与血管内的纤溶过程。它在神经系统中扮演着双重角色：既能促进神经突触的生长和神经元迁移，助力大脑发育，又参与学习记忆的关键过程——长时程增强（LTP）。然而，tPA并非以单一形态行使其职能。它最初被分泌为单链形式（single-chain tPA, sc-tPA），可被纤溶酶（Plasmin）等切割转化为双链形式（two-chain tPA, tc-tPA）。有趣的是，这两种形态有时会发挥截然相反的作用。例如，在调控N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR）信号时，sc-tPA能增强钙离子内流，而tc-tPA则通过促进GluN2B亚基内吞来抑制该信号。这种“同源异效”现象引出一个核心问题：在大脑实质中，究竟是谁、又如何精准调控着sc-tPA向tc-tPA的转化？

为解开这一谜团，Hortense Triniac等人在《Cell Death and Disease》上发表了最新研究。他们利用Alexa Fluor标记的重组tPA，结合多种药理学方法，系统评估了不同脑细胞处理sc-tPA的能力及其机制。

关键技术方法

研究主要采用原代细胞培养（包括小鼠皮质神经元、星形胶质细胞、脑内皮细胞及PC-12、HEK-293T细胞系），通过荧光标记蛋白质（tPA⁴⁸⁸）孵育与SDS-PAGE电泳定量sc-tPA/tc-tPA比值变化；利用激光扫描共聚焦显微镜动态监测纤溶酶活性；通过突变体构建（如缺失Kringle 2结构域的ΔK2-tPA）及特异性抑制剂（如aprotinin、α₂-antiplasmin、EACA/TXA）干预，明确关键分子与结构域的功能。

研究结果

1. 成熟皮质神经元特异性切割sc-tPA

将tPA⁴⁸⁸与成熟皮质神经元（12-14 DIV）共孵育10分钟，sc-tPA/tc-tPA比值显著下降（33.8%），且随时间延长切割加剧（60分钟时下降63.5%），而对照蛋白BSA⁵⁵⁵无变化。

即使神经元经冻融裂解后，切割活性仍保留，表明该过程依赖于细胞表面成分，而非细胞内吞或外排作用。未成熟神经元（7 DIV）的切割速率显著低于成熟神经元，提示该能力随神经元成熟而增强。

2. 切割机制依赖纤溶酶活性

加入广谱丝氨酸蛋白酶抑制剂aprotinin或特异性纤溶酶抑制剂α₂-antiplasmin后，tPA切割被完全或部分抑制。共聚焦显微镜下，tPA⁴⁸⁸处理组纤溶酶荧光底物信号增强，而aprotinin组信号骤减，且神经元结合tPA量减少，证实纤溶酶生成是切割关键。

3. tPA的Kringle 2结构域不可或缺

赖氨酸类似物（EACA、TXA）意外增强切割速率，可能通过稳定纤溶酶或改变其构象。而缺失Kringle 2结构域的ΔK2-tPA⁴⁸⁸在神经元中几乎不被切割，说明该结构域是激活纤溶酶原的必要条件。羧肽酶B（CpB）处理或Plg-RKT抗体均未显著影响切割，提示纤溶酶原结合不依赖羧基末端赖氨酸或Plg-RKT受体。

4. tPA自身蛋白酶活性为切割前提

经GGACK共价修饰失活的tPA（tPA-GGACK）不能被神经元切割，且其在体外仅可被纤溶酶而非纤溶酶原激活。在无纤溶酶原培养基中培养的神经元丧失切割能力，而短暂预孵育纤溶酶原后可恢复该功能，完整验证了“tPA激活纤溶酶原→纤溶酶反馈切割tPA”的循环机制。

结论与意义

本研究首次阐明成熟皮质神经元通过三步级联反应特异性调控tPA形态转化：（1）纤溶酶原结合于神经元表面；（2）sc-tPA激活纤溶酶原生成纤溶酶；（3）纤溶酶切割sc-tPA转化为tc-tPA。该过程依赖tPA的Kringle 2结构域及其蛋白酶活性，且独立于经典LBS依赖的纤溶酶原结合途径。

这一发现揭示了tPA功能调控的新维度：神经元可通过调控sc-tPA/tc-tPA平衡，精确影响NMDAR信号通路，进而参与神经发育、可塑性及学习记忆的精细调控。尤其在脑发育早期，纤溶酶原高表达可能通过此机制影响神经元迁移与环路形成。未来针对tPA异构体比例的研究，将为理解神经系统疾病（如卒中、神经退行性疾病）中tPA双向作用提供新靶点。