基于仿真的PAINT参数空间探索，以实现精确的分子定量

《Nanoscale》：Simulation-guided exploration of PAINT parameter space for accurate molecular quantification

分子量化；PAINT技术；探针动力学；神经网络模型；Sobol敏感性分析；空间分布解析；实验参数优化；非DNA探针设计

　　单分子定位显微镜（Single-Molecule Localization Microscopy, SMLM）是一类用于可视化和量化表面结合生物分子的先进技术。这类技术通过分离单个荧光团的发射时间，实现对分子位置的高精度定位，从而突破传统光学显微镜的衍射极限。其中，DNA点积累成像纳米拓扑技术（DNA-PAINT）因其明确的结合动力学特性和相对简单的仪器需求，被认为是高通量分子量化的重要候选方法。DNA-PAINT已被成功应用于合成生物功能化表面（如DNA折纸、纳米颗粒）和生物底物，用于成像多种生物分子，包括核酸、蛋白质和脂质。然而，尽管其应用范围广泛，DNA-PAINT在高密度系统中的分子量化仍面临挑战，尤其是在分子间距离小于显微镜分辨率的情况下，传统的量化方法难以准确区分每个分子。

为了克服这一限制，研究人员开发了定量PAINT（qPAINT）方法，该方法通过结合动力学推断分子数量。然而，qPAINT依赖于严格的成像条件，以避免同一衍射极限区域内发生多次结合事件，这限制了其在高通量分析中的应用。另一种方法——分辨率增强通过顺序成像（RESI）——通过DNA条形码技术克服了这一问题，但其在分子密度增加时的可扩展性较差。此前的研究中，我们引入了一种基于模拟的分析框架，使得在高密度区域也能实现分子量化和空间分布分析，同时保持较短的采集时间。

本研究通过构建一个模拟引导的框架，系统地探索了PAINT参数空间，旨在识别能够实现高精度分子量化的条件。研究中定义了关键PAINT输出的检测阈值，如点扩散函数密度（PSF density）、定位云密度（localization cloud density）和结合事件密度（binding event density），以确保对分子密度的估计准确度达到90%以上，并能够对空间分布进行统计学解释。通过蒙特卡洛模拟生成的数据，训练了一个神经网络代理模型，用于执行Sobol敏感性分析，揭示了探针动力学和浓度对输出变量的主要影响。这一模型不仅能够快速绘制可行的参数范围，还表明在高密度、聚集的系统中，若要实现可解释的空间分布量化，要么需要对分子结构有先验知识，要么需要提高空间分辨率。

通过模拟不同探针浓度和结合动力学参数下的数据，我们发现PSF密度在一定范围内可保持高检测精度，但当PSF密度超过临界值时，检测误差会显著增加。定位云的识别则依赖于云密度和分子分布的特性，特别是在分子聚集的情况下，只有在较低的云密度下才能实现高精度的识别。为了提高分子量化的准确性，研究引入了生物分子采样补偿（BiSC）方法，该方法通过模拟探针与目标分子的结合事件，建立了分子密度与结合事件密度之间的线性关系，从而估算真实的分子密度。通过多次重复采样和回归分析，我们验证了BiSC方法的可靠性，并发现其在不同系统中表现一致。

研究还探讨了探针动力学参数对PAINT输出的影响，采用Sobol指数进行全局敏感性分析。结果表明，探针结合速率（k_on）、解离速率（k_off）和探针浓度（c_img）是影响PAINT输出的主要因素，而采集时间（t）的影响相对较小。此外，研究发现，对于高密度、聚集的分子系统，即使采用高浓度探针，也难以实现准确的空间分布量化，因此需要进一步提高空间分辨率或开发新的分析方法。尽管提高分辨率可以改善量化效果，但通常会带来采集时间增加和通量下降的问题。

本研究的结果为设计下一代非DNA基的PAINT兼容探针提供了重要的理论依据和实践指导。传统的DNA标记方法可能引入误差并干扰分子环境，影响测量的准确性。因此，开发具有PAINT兼容结合动力学的非DNA探针成为当前研究的一个关键方向。通过模拟和分析，我们确定了不同探针参数下可量化的分子密度范围，并提出了基于探针得分的量化评估方法。该方法不仅考虑了分子密度，还结合了空间分布的可解释性，使得探针设计更加灵活和高效。

此外，研究强调了在高密度、聚集系统中，空间分布量化需要更精细的参数调整和更高的分辨率。通过模拟和实验验证，我们发现探针的结合动力学参数在不同系统中具有显著的差异，这需要在实验设计时进行针对性优化。对于非随机分布的分子系统，如分散或聚集分布，其可解释性区域受到分子采样率和分布评分的双重限制。因此，在选择探针和成像条件时，必须综合考虑这些因素，以确保量化结果的准确性和可解释性。

研究还指出，对于需要高精度空间分布量化的系统，例如核孔、黏附点和免疫突触等生物系统，提升PAINT分辨率或引入更先进的分析方法是必要的。然而，这些改进往往伴随着采集时间的增加和通量的降低。因此，开发高效的机器学习分析框架，能够基于PAINT精度、真实分子密度、采样率和分布评分之间的关系，实现逆向估算真实分子分布，成为未来研究的重要方向。

总之，本研究通过模拟引导的方法，系统地分析了PAINT参数对分子量化的影响，揭示了探针动力学和浓度在量化精度中的主导作用。这一研究不仅为优化PAINT实验提供了定量指导，还为开发非DNA基的PAINT兼容探针提供了理论支持，从而拓展了PAINT在更广泛分子系统中的应用。通过明确量化限制和参数影响，研究为单分子成像技术的进一步发展奠定了基础，尤其是在高密度、复杂空间分布的生物系统中，这一方法具有重要的科学价值和实际意义。