心脏肌钙蛋白I切换结构域中的人类变异导致一种新型小鼠模型出现舒张功能障碍

《Stroke: Vascular and Interventional Neurology》：Human Variant in the Cardiac Troponin I Switch Domain Causes Diastolic Dysfunction in a Novel Mouse Model

心肌病相关cTnI A157V突变的小鼠模型显示舒张功能受损、无心脏纤维化但存在转录组重塑。该模型通过CRISPR/Cas9引入Tnni3 A158V突变（人A157V同源），发现其导致心肌舒张期压力变化减小、肌原纤维松弛时间延长，并伴随能量代谢相关基因上调及收缩相关基因下调。研究证实该突变单独即可引发分子表型变化，为研究舒张障碍提供新模型。

　　心脏肌钙蛋白I（Cardiac Troponin I，简称cTnI）是由基因*TNNI3*编码的一种高度保守的肌钙蛋白复合物亚基，其主要功能是通过阻止肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用来抑制心脏收缩。在正常生理条件下，cTnI的“开关螺旋”区域（残基149–160）在钙离子浓度较低时与肌动蛋白结合，而在钙离子浓度较高时则与肌钙蛋白C结合，从而调节肌钙蛋白复合物的构象变化，进而影响横桥的形成和心肌收缩的启动。这种动态调节机制在心脏收缩和舒张过程中起着关键作用。

在某些情况下，*TNNI3*基因的突变会导致与cTnI相关的疾病，例如肥厚型心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM）和限制型心肌病（Restrictive Cardiomyopathy, RCM）。这些突变可能在同一家族中表现出不同的临床表型，即使携带相同的遗传变异。这表明，尽管遗传背景相同，但个体之间的表型差异可能与环境因素、其他基因的相互作用或突变的具体位置和性质有关。因此，深入研究这些突变对心脏功能的影响，有助于更好地理解心肌病的发病机制，并为开发新的治疗策略提供依据。

目前，针对薄丝蛋白心肌病的靶向治疗方案尚不成熟。然而，动物模型在揭示*TNNI3*相关疾病方面发挥了重要作用。例如，通过基因编辑技术，研究人员已经成功构建了多种与人类心肌病相似的动物模型。然而，这些研究大多集中在整体基因突变，而较少关注“开关域”内的具体变异。因此，建立一种能够模拟人类A157V变异的动物模型，对于进一步探讨该突变对心脏功能的影响具有重要意义。

A157V是一种已知的致病性“开关域”变异，其在人类中与家族性心肌病相关。为了模拟这一变异，研究人员利用CRISPR/Cas9技术在小鼠中引入了*Tnni3*基因的点突变（c.470C>T，A158V）。由于小鼠cTnI序列中包含一个额外的氨基酸，A158V在小鼠中的位置与人类A157V相对应。这种基因编辑方法使得研究人员能够在小鼠中研究A157V变异对心脏功能的具体影响，而无需完全复制人类的基因结构。

为了评估A158V变异对心脏功能的影响，研究人员对小鼠进行了连续的经胸超声心动图检查。结果显示，在任何年龄段，无论是纯合子（A158V^Hom）还是野生型（WT）小鼠，其心脏功能参数均无显著差异。这表明，A158V变异在短期内并未对心脏的收缩功能造成明显影响。然而，进一步的侵入性血流动力学分析揭示了更为复杂的机制。在年轻（3–4个月）和年老（12–14个月）小鼠中，A158V^Het（杂合子）和A158V^Hom（纯合子）小鼠的最小dP/dT（压力变化的最大速率）均显著低于野生型小鼠。此外，随着年龄的增长，A158V^Hom小鼠的最小dP/dT下降趋势更为明显，提示该变异可能在长期中对心脏的舒张功能产生负面影响。

为了进一步探讨A158V变异对心肌细胞水平的影响，研究人员采用快速溶液切换法研究了年老小鼠的心室肌原纤维。结果显示，A158V^Hom小鼠的肌原纤维表现出较长的线性舒张期，而野生型小鼠的舒张期相对较短。这一发现与之前在活体水平上观察到的舒张功能障碍相吻合，表明A158V变异不仅影响整体心脏功能，还可能在细胞层面引发一系列变化。

cTnI在丝氨酸23/24位点的磷酸化（pTnI）是心肌舒张的重要调控机制之一。该磷酸化过程主要由蛋白激酶A（PKA）介导，而PKA的激活则依赖于β-肾上腺素能受体的刺激。研究人员通过Western blot分析发现，A158V^Hom小鼠的pTnI水平相较于野生型小鼠有所下降，但未达到统计学显著性（P=0.064）。这一趋势可能与β-肾上腺素能反应的减弱有关，而β-肾上腺素能反应的减弱已被认为是导致舒张功能障碍的重要因素。因此，A158V变异可能通过影响cTnI的磷酸化状态，间接导致心肌舒张功能的受损。

此外，研究人员还对年老小鼠的左心室组织进行了批量RNA测序（RNA-sequencing），以探讨A158V变异对基因表达的影响。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）结果显示，A158V^Hom小鼠与野生型小鼠的基因表达模式存在明显差异，而A158V^Het小鼠的基因表达则介于两者之间。差异表达分析进一步表明，A158V^Hom小鼠中存在351个显著改变的蛋白编码基因。其中，一些与应激和炎症相关的基因（如*Timp1*、*Serpina1*、*Serpinb1a*和*Lcn2*）被显著上调，而一些与结构和代谢调控相关的基因（如*Atcay*、*Tmem150c*和*Tchp*）则被显著下调。这些基因表达的变化提示，A158V变异可能通过影响心肌细胞的代谢和结构调控，间接导致心脏功能的改变。

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进一步揭示了A158V^Hom小鼠中某些关键通路的变化。结果显示，与能量代谢和氧化磷酸化相关的通路被激活，而与心肌收缩相关的通路则被抑制。这些通路的变化可能与心肌细胞在面对应激时的适应性反应有关，但也可能对心脏功能产生不利影响。例如，能量代谢通路的激活可能表明心肌细胞在应对某些压力时需要更多的能量支持，而心肌收缩通路的抑制则可能影响心脏的收缩能力。

为了进一步验证这些基因表达变化对心脏功能的具体影响，研究人员还分析了基因表达水平与特定基因集之间的关系。结果显示，A158V^Hom小鼠的基因表达变化最为显著，而A158V^Het小鼠则表现出与A158V^Hom小鼠相似但程度较轻的变化。这种基因表达的分级效应与之前观察到的血流动力学表型相吻合，表明A158V变异可能通过改变基因表达模式，进而影响心脏功能。

相比之下，A158V^Het小鼠与野生型小鼠之间的基因表达差异较小，仅在少数基因中表现出显著变化。例如，*Tnc*基因（编码心肌细胞外基质蛋白）在A158V^Het小鼠中被显著上调，这可能与心肌细胞外基质的重塑有关。而*Acot10*基因（编码脂肪酸代谢相关蛋白）在A158V^Hom小鼠中被显著上调，但在A158V^Het小鼠中则没有明显变化。这提示，A158V变异可能在不同基因型中引发不同的基因表达变化，从而影响心脏的代谢和结构特性。

总体来看，A158V变异在小鼠模型中表现出一系列与心脏舒张功能相关的表型变化，包括最小dP/dT的下降、肌原纤维舒张期的延长以及特定基因表达模式的改变。这些变化并未伴随明显的结构性病变，如心肌纤维化，但可能在长期中导致心脏功能的逐渐恶化。因此，该模型不仅有助于理解A158V变异对心脏功能的具体影响，还为研究心肌病的发病机制和开发新的治疗策略提供了重要的实验基础。

在临床实践中，A157V变异已被发现与家族性心肌病相关，并且在某些情况下，该变异可能导致心肌移植的需要。因此，建立一个能够模拟这一变异的小鼠模型，对于研究心肌病的早期病理变化和潜在的治疗靶点具有重要意义。此外，由于目前缺乏针对薄丝蛋白心肌病的靶向治疗方案，这种模型还可以用于评估新的药物或治疗方法的效果，特别是在影响心脏舒张功能方面。

值得注意的是，尽管A158V^Hom小鼠表现出明显的舒张功能障碍，但其心脏结构并未发生显著改变。这表明，心脏功能的改变可能在结构变化之前就已经发生，因此，研究这些功能变化的机制对于早期诊断和干预具有潜在价值。此外，该模型还揭示了基因表达变化与心脏功能之间的复杂关系，提示心肌细胞的代谢和结构调控可能在心脏功能的维持中起着关键作用。

总之，A158V变异在小鼠模型中表现出一系列与心脏舒张功能相关的表型变化，包括最小dP/dT的下降、肌原纤维舒张期的延长以及特定基因表达模式的改变。这些变化并未伴随明显的结构性病变，但可能在长期中导致心脏功能的逐渐恶化。因此，该模型不仅有助于理解A158V变异对心脏功能的具体影响，还为研究心肌病的发病机制和开发新的治疗策略提供了重要的实验基础。同时，该模型也强调了基因表达变化在心脏功能调节中的重要性，为未来的相关研究提供了新的方向。