靶向递送GPX4激活剂的人脐带间充质干细胞外泌体通过抑制铁死亡促进脊髓损伤修复

《Journal of Nanobiotechnology》：Targeted delivery of the GPX4 activator via HUCMSC-derived exosomes inhibits ferroptosis in spinal cord injury

本研究针对脊髓损伤(SCI)后铁死亡导致神经元死亡的关键难题，开发了TAT/RVG肽修饰的人脐带间充质干细胞外泌体(MSC-EXOR&T-GA)靶向递送系统。该系统能有效穿透血脊髓屏障，特异性靶向损伤区域，通过激活谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和调控铁代谢，显著抑制脂质过氧化和炎症反应，促进神经元存活、轴突再生和髓鞘修复，为脊髓损伤治疗提供了创新策略。

　　

当脊髓遭受严重损伤时，一场复杂的分子级联反应在神经组织内悄然上演，其中铁死亡作为一种新发现的程序性细胞死亡方式，正成为阻碍神经功能恢复的关键因素。这种铁依赖性的细胞死亡过程由脂质过氧化物堆积驱动，而中枢神经系统中富含的多不饱和脂肪酸使其神经元和少突胶质细胞尤其脆弱。在损伤微环境中，游离铁离子通过芬顿反应产生活性氧，攻击细胞膜结构，同时内源性抗氧化防御系统——尤其是关键酶GPX4的功能受损，共同加剧了神经细胞的毁灭。更为棘手的是，传统的药物治疗因难以突破血脊髓屏障(BSCB)而在损伤区域分布有限，疗效大打折扣。

面对这一挑战，范宝友团队在《Journal of Nanobiobiology》上发表的研究，巧妙利用天然递送载体——人脐带间充质干细胞来源的外泌体(MSC-EXOs)，构建了一种多功能靶向治疗系统。研究人员通过基因工程手段将细胞穿膜肽TAT和神经元靶向肽RVG修饰于外泌体表面，并装载GPX4激活剂(GA)，形成MSC-EXO_R&T-GA复合体。这一设计使外泌体既能够高效穿透生物屏障，又能精准识别神经细胞，实现药物的靶向递送。

研究的关键技术方法包括：通过超速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清中分离外泌体；使用CP05锚定肽将TAT和RVG肽修饰到外泌体表面；通过DIC/NHS介导的酰胺反应将GA装载到工程化外泌体上；利用透射电镜和纳米颗粒跟踪分析表征外泌体；建立小鼠脊髓挫伤模型并通过尾静脉注射给药；通过免疫荧光、Western blot、RNA测序等技术评估治疗效果和机制。

表征和功能评估多功能MSC-EXO_R&T-GA靶向神经元的能力

研究人员首先成功构建了多功能外泌体系统。透射电镜显示MSC-EXOs、MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA均呈现典型双层膜结构，纳米颗粒跟踪分析显示它们具有相似的粒径分布。外泌体标志物CD9、CD63和TSG101表达阳性，而细胞器标志物Calnexin为阴性，证实了外泌体的纯度。免疫荧光实验显示，MSC-EXO_R&T-GA能成功进入HT22细胞系，并在细胞质内清晰分布，RVG-CP05、TAT-CP05和MSC-EXOs的荧光信号重叠，证实了肽的成功修饰。

体内实验进一步证实了修饰外泌体的靶向能力。尾静脉注射后，在脊髓损伤区域观察到明显的RVG-CP05(绿色)、TAT-CP05(红色)和MSC-EXO(蓝色)信号分布，表明修饰外泌体成功靶向脊髓损伤部位。与MSC-EXO_R组相比，MSC-EXO_R&T组在损伤区域显示更强的荧光信号，表明TAT修饰增强了外泌体的组织靶向和穿透效率。

MSC-EXO_R&T-GA在体外抑制神经元和少突胶质细胞铁死亡

为评估MSC-EXO_R&T-GA对铁死亡的抑制作用，研究团队在HT22神经元和OLN93少突胶质细胞系中建立了RSL3诱导的铁死亡模型。结果显示，随着RSL3浓度增加，HT22细胞活力显著下降，而MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA处理能显著提高细胞活力，其中MSC-EXO_R&T-GA组的保护效果最优。活性氧(ROS)水平在MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA组显著降低，丙二醛(MDA)水平也明显下降，表明氧化应激得到有效缓解。

R&T-GA在体外对RSL3诱导的铁死亡的保护作用评估'>

在RSL3诱导的HT22细胞铁死亡模型中，MSC-EXO_R&T-GA显著提高了GPX活性，降低了细胞内铁水平。Western blot分析显示，RSL3处理显著增加了NCOA4表达，降低了GPX4和FTH1水平，而MSC-EXO_R&T-GA共处理有效逆转了这些变化。在OLN93细胞中也观察到类似结果，表明MSC-EXO_R&T-GA能通过调节氧化应激和铁稳态，有效保护神经元和少突胶质细胞免受铁死亡诱导的损伤。

MSC-EXO_R&T-GA促进脊髓损伤后功能恢复

为评估治疗效果，研究团队进行了多项行为学和组织学分析。Basso小鼠评分(BMS)显示，与损伤组相比，MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA治疗组后肢运动功能显著改善，其中MSC-EXO_R&T-GA组效果最为显著。CatWalk步态分析显示，治疗组在运动协调性和运动恢复方面有显著改善，MSC-EXO_R&T-GA组在步态序列规律性指数和最大接触面积方面得分最高。游泳测试结果支持这些发现，MSC-EXO_R&T-GA治疗组小鼠的游泳得分明显高于损伤组。

R&T-GA在脊髓损伤模型中的治疗效能评估'>

感觉功能通过热板试验评估，与损伤组相比，MSC-EXO_R&T-GA治疗组反应时间显著缩短，表明感觉功能改善。自主神经功能通过膀胱直径测量评估，MSC-EXO_R&T-GA显著减小了膀胱尺寸，表明自主神经调节功能恢复。MRI显示MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA组病变体积减小，其中MSC-EXO_R&T-GA治疗组病变体积最小。运动诱发电位(MEPs)分析显示，治疗组神经元传导性显著恢复，MSC-EXO_R&T-GA组振幅显著大于损伤组。

MSC-EXO_R&T-GA增强神经元存活并减少星形胶质细胞增生

免疫荧光分析显示，损伤组神经元数量显著减少，星形胶质细胞活性显著增加，尤其在病变核心区域。相比之下，MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA组神经元存活增加，星形胶质细胞活性降低，其中MSC-EXO_R&T-GA组效果最为显著。定量分析显示，MSC-EXO_R&T-GA组NeuN+细胞数量显著多于损伤组和MSC-EXO组，表明显著的神经保护作用。GFAP荧光强度在损伤组显著升高，而在MSC-EXO_R&T-GA组显著降低，表明星形胶质细胞激活减少和胶质瘢痕形成减少。

MSC-EXO_R&T-GA促进少突胶质细胞在脊髓损伤中的存活

少突胶质细胞在髓鞘形成中起关键作用，其存活和功能恢复对神经修复至关重要。免疫荧光染色使用Oligo2和髓鞘碱性蛋白(MBP)进行评估。损伤组Oligo2+细胞数量显著少于假手术组，而MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA治疗组Oligo2+细胞数量显著增加，其中MSC-EXO_R&T-GA组达到与假手术组相当的水平，表明对少突胶质细胞有更强的保护作用。MBP染色结果显示，损伤组MBP荧光强度显著降低，表明髓鞘损伤严重。相比之下，MSC-EXO_R&T和MSC-EXO_R&T-GA治疗显著增加了MBP荧光强度，其中MSC-EXO_R&T-GA处理对髓鞘再生的影响最大。

MSC-EXO_R&T-GA通过铁蛋白吞噬抑制和GPX4激活的双重调节抑制铁死亡

为探索MSC-EXO_R&T-GA调节铁死亡的潜在机制，研究人员在损伤后第7天进行了RNA测序。热图分析显示，MSC-EXO_R&T-GA治疗上调了与铁稳态和抗氧化防御相关的基因，如对铁储存至关重要的FTH1，以及氧化应激调节因子Sqstm1，同时下调了促进铁死亡的基因如驱动脂质过氧化的ACSL4。GSEA显示"铁离子转运"通路显著富集，表明MSC-EXO_R&T-GA对维持铁稳态至关重要。

R&T-GA在脊髓损伤模型中铁死亡调节的转录组和分子分析'>

GO富集分析进一步证实治疗与"铁离子结合"和"细胞对铁离子的反应"等术语相关，这些术语对铁死亡调节至关重要。KEGG通路富集分析显示轴突导向、TNF信号通路和铁死亡通路显著富集。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析确定FTH1和NCOA4为中心枢纽基因，突出了它们在铁死亡调节中的关键作用。Western blot分析验证了这些发现，铁死亡防御蛋白GPX4通过MSC-EXO_R&T-GA治疗恢复，而脂质过氧化标志物4HNE显著降低，表明铁死亡被有效抑制。

该研究开发的基于MSC来源外泌体的多功能靶向递送系统，成功解决了脊髓损伤治疗中药物递送效率低的关键难题。通过TAT和RVG肽的协同作用，工程化外泌体实现了对损伤区域的精准靶向和高效渗透，同时借助GPX4激活剂的负载，在抑制铁死亡、调节铁代谢和减轻炎症方面展现出多重疗效。这种创新策略不仅为脊髓损伤修复提供了新思路，也为其他神经系统疾病的治疗开辟了新途径。研究证实，外泌体作为天然递送载体，具有良好的生物相容性和低免疫原性，加上其固有的免疫调节和神经保护特性，使其在临床转化方面具有显著优势。虽然该研究在急性脊髓损伤模型中证明了治疗效能，但针对慢性脊髓损伤的靶向效率、体内降解动力学及长期疗效仍需进一步探索。未来研究可关注与其他治疗策略的联合应用，以最大化患者康复效果。