鼻腔发育与成体嗅觉系统中Opsin 3与Opsin 5的相反表达模式及其功能意义

《Chemical Senses》：Opposing expression pattern of opsin 3 and opsin 5 in the developing and adult nasal epithelium

本刊推荐：为解决鼻腔感觉上皮与呼吸上皮分子标记缺乏及非视觉光感受器功能未知的问题，研究人员利用Opn3-eGFP/Opn5-tdTomato双报告小鼠模型开展鼻腔发育与成体表达谱系研究。结果表明Opn3特异性表达于Sox2+/Ker8+支持细胞的感觉上皮，而Opn5局限于Foxj1+呼吸上皮，二者形成互补表达模式。虽基因敲除小鼠未表现嗅觉行为缺陷，但首次确立Opn5作为呼吸上皮新标记物，为鼻腔区域划分提供新型分子工具。

　　

在哺乳动物的鼻腔世界中，存在着两个功能迥异却又紧密相邻的领域——负责气味感知的嗅觉感觉上皮和承担空气净化功能的呼吸上皮。虽然科学家们已经识别出许多界定嗅觉感觉区域及其多种细胞类型的分子标记，但对于呼吸上皮的分子特征却知之甚少。更令人惊奇的是，近年来研究发现，一些传统认为仅在眼睛中发挥功能的光感受器——视蛋白（Opsins），实际上在全身多种非视觉组织中广泛表达，执行着从生物钟调节到能量代谢等多种重要功能。这种"跨界"表达现象引发了研究人员的浓厚兴趣：这些光敏感分子是否也在鼻腔这个特殊环境中存在？它们又可能扮演着什么角色？

近期发表在《Chemical Senses》上的研究正是针对这一科学问题展开。研究团队聚焦于两种非视觉光感受器——Opsin 3（Opn3）和Opsin 5（Opn5），它们在光谱敏感性上各有特色：Opn3对蓝光（约465纳米）最为敏感，而Opn5则偏好紫外线A区域（约380纳米）。先前的研究已经提示Opn3在小鼠胚胎早期（E9.5）的嗅觉基板中就有表达，但其在胚胎后期、出生后乃至成体鼻腔中的表达模式，以及是否存在其他非视觉光感受器共同参与鼻腔功能，都是未解之谜。

为了回答这些问题，研究团队巧妙地运用了基因工程小鼠模型，包括Opn3-eGFP报告小鼠和Opn5-tdTomato报告小鼠，结合多种细胞特异性标记物的免疫组织化学分析，系统描绘了这两种光感受器在鼻腔中的时空表达图谱。他们的研究发现揭示了令人惊讶的规律：Opn3和Opn5在鼻腔上皮中呈现出截然相反却又互补的表达模式。从胚胎发育早期开始，Opn3就特异性地定位在感觉上皮区域，而Opn5则在发育后期"登场"，出现在呼吸上皮中。这种模式在成体小鼠中依然保持，Opn3主要在嗅觉感觉上皮的Sox2⁺/Ker8⁺支持细胞中表达，而Opn5则局限于呼吸上皮的特定细胞群体。

研究人员采用的主要技术方法包括：利用Opn3-eGFP和Opn5-tdTomato双报告基因小鼠模型进行谱系追踪；通过免疫组织化学技术检测Foxj1、Ker8、OMP、Sox2和Tubb3等细胞标记物的表达；使用HCR^TM Gold RNA-FISH进行Opn5 mRNA原位验证；对Opn3^-/-和Opn5^-/-基因敲除小鼠进行埋藏食物行为学测试评估嗅觉功能；采用激光共聚焦显微镜和全玻片扫描系统进行高分辨率成像分析。

胚胎期Opn3和Opn5在鼻腔中的限制性表达模式

研究人员首先将目光投向胚胎发育阶段。在E13.5时期，当鼻腔上皮已经清晰分化为感觉区和呼吸区时，Opn3的表达与未成熟嗅觉感觉神经元标记物Tubb3完全共定位，不仅存在于感觉上皮内部，还出现在迁移出上皮的嗅觉神经元中。与此形成鲜明对比的是，此时呼吸上皮区域完全没有检测到Opn5的表达。随着发育进程推进到E17.5，Opn3的表达依然稳定维持在感觉上皮区域，而Opn5则开始"崭露头角"，在呼吸上皮中出现少量散在阳性细胞。这一发现通过HCR RNA-FISH技术得以验证，确认了Opn5转录本的存在。值得注意的是，与主要鼻腔类似，犁鼻器（vomeronasal organ）中也检测到Opn3和Tubb3的表达，但缺乏Opn5信号。

出生后呼吸上皮中Opn5表达的扩展

出生后早期（P14）是小鼠依赖嗅觉识别母体、获取生存资源的关键阶段。研究人员发现，此时Opn3的表达依然严格限定在感觉上皮区域，而Opn5的表达范围则有所扩大，在呼吸上皮中出现更多散在分布的阳性细胞，尤其是在鼻腔的远端部分。虽然两种蛋白的表达区域总体上互不重叠，但在感觉上皮与呼吸上皮的交界处，可以观察到少量Opn3⁺和Opn5⁺细胞相互交错的现象。通过Foxj1（呼吸上皮标记）和Tubb3（感觉上皮标记）的双重染色，研究人员确认了Opn3和Opn5的表达区域分别与感觉区和呼吸区完美对应。

成体小鼠鼻腔上皮中Opn3和Opn5的表达

在成体小鼠中，这种互补表达模式更加明显。呼吸上皮中的Opn5⁺细胞数量进一步增加，而Opn3则在感觉上皮中保持广泛表达。通过细胞类型特异性标记物的共定位分析，研究人员精确确定了Opn3的表达细胞类型：它与Ker8和Sox2共同表达于支持细胞的细胞质中，这些细胞的胞体位于上皮的顶端侧。有趣的是，虽然上皮基底部的Sox2⁺球状基底细胞被GFP阳性结构所包围，但这些细胞本身并不表达Opn3。同时，Opn3既不表达于Tubb3⁺的未成熟嗅觉感觉神经元，也不存在于OMP⁺的成熟嗅觉感觉神经元中。这一发现与支持细胞的已知形态特征相符——它们从顶端的胞体发出细长突起，贯穿整个上皮层，包裹和支持着各种类型的嗅觉神经元和基底细胞。

Opn3和Opn5缺陷小鼠的嗅觉行为测试

既然Opn3在成体嗅觉感觉上皮中广泛表达，一个自然而然的问题是：它是否参与气味感知功能？研究人员采用了经典的埋藏食物测试来评估基因敲除小鼠的嗅觉能力。经过食物剥夺的Opn3^+/+和Opn3^-/-小鼠被置于测试笼中，需要在 bedding材料下寻找隐藏的奥利奥饼干碎片。令人意外的是，无论是Opn3缺失还是Opn5缺失，都没有影响小鼠寻找隐藏食物的能力，它们与野生型同窝小鼠的表现没有显著差异。值得注意的是，Opn3小鼠（包括野生型和敲除型）在第三次测试（T3）中寻找食物所需时间明显短于第一次测试（T1），表明它们对这一任务产生了学习记忆，而这种学习能力并不依赖于Opn3的存在。相比之下，Opn5小鼠系则没有表现出明显的学习效应，这可能反映了不同遗传背景对行为测试的影响。

Opn3和Opn5缺陷小鼠鼻腔腔的分析

尽管表达模式存在明显差异，但基因敲除并没有导致明显的鼻腔表型。对Opn3^-/-和Opn5^-/-成体小鼠的组织学分析显示，其鼻腔形态与野生型对照组没有差异。各种分子标记物的表达模式也保持正常：Tubb3在感觉上皮中的表达、Foxj1在呼吸上皮中的分布、OMP⁺成熟嗅觉感觉神经元的数量、以及Sox2⁺/Ker8⁺支持细胞和Sox2⁺球状基底细胞的分布格局，在基因敲除小鼠中都没有发生改变。这些结果表明，虽然Opn3和Opn5在鼻腔中具有明确的区域特异性表达，但它们对于鼻腔上皮的基本组织结构和细胞特化并非必需。

这项研究的重要发现在于确立了Opn5作为呼吸上皮的新潜在标记物，与感觉上皮中的Opn3形成鲜明的对比。这种相反的表达模式与其他系统中的发现相呼应，例如在能量代谢调节中，Opn3和Opn5就发挥着相互拮抗的作用：Opn3促进产热，而Opn5则抑制这一过程。

特别值得关注的是Opn3在支持细胞中的特异性表达。支持细胞作为嗅觉上皮的关键组成部分，不仅通过缝隙连接与嗅觉感觉神经元进行通信，调节其敏感性，还参与生成包围嗅觉感觉神经元的特殊黏液，支持气味转导过程。虽然本研究没有发现Opn3缺失会导致支持细胞标记物表达改变或嗅觉行为缺陷，但这并不意味着Opn3在这一区域没有功能。相反，它可能以更加精细的方式调节嗅觉功能，例如通过光敏感机制调节嗅觉系统的昼夜节律同步化。已有研究表明，嗅球具有与嗅吸周期相关的昼夜节律，这一节律与记忆形成密切相关。

从更广阔的视角来看，鼻腔中的光感受器可能为整个嗅觉系统提供光暗周期的信息，帮助动物将嗅觉感知与昼夜时间相协调。另一种可能是，Opn3和Opn5可能影响尚未测试的生理系统和行为，如信息素依赖的配偶选择、亲代-幼仔 bonding或捕食者-猎物关系等，这些功能可能部分依赖于光信号。

综上所述，这项研究首次全面揭示了Opn3和Opn5在鼻腔发育和成体阶段的互补表达模式，确定了Opn3在支持细胞中的特异性定位，并将Opn5确立为呼吸上皮的新分子标记。虽然基因缺失没有引起明显的嗅觉行为缺陷，但这一发现为理解非视觉光感受器在鼻腔中的潜在功能提供了重要基础。未来的研究需要进一步探索这些光敏感分子是否以更精细的方式调节嗅觉功能，是否影响黏液生成，或者是否为嗅球提供昼夜节律信息。无论如何，这项工作为我们理解鼻腔这一复杂感官区域的组织原理和潜在的光调节机制开辟了新视角。