一种优化的小鼠调节性T细胞基因编辑及体外扩增方法及其在肿瘤免疫治疗中的应用

《Journal of Leukocyte Biology》：Method for generation and ex vivo expansion of genetically edited mouse Tregs

本研究针对基因编辑小鼠调节性T细胞（Tregs）体外扩增效率低的技术难题，通过优化培养基配方（添加高浓度IL-2和HEPES缓冲液）、改进换液方式（避免离心采用轻柔移液）及调整TCR刺激时长，显著提升了SRC-3基因敲除mTregs的扩增效率。该方案为Treg细胞疗法的临床前研究提供了可靠技术支撑。

　　

在免疫系统的精密调控网络中，调节性T细胞（Regulatory T cells, Tregs）扮演着不可或缺的角色。这群特殊的CD4⁺ T细胞如同免疫反应的“刹车系统”，通过维持外周免疫耐受来避免自身免疫病的发生。然而，当这一平衡被打破，Tregs的功能异常可能引发多发性硬化、类风湿性关节炎等严重自身免疫疾病。更令人深思的是，在肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中，癌细胞会巧妙“劫持”Tregs的免疫抑制功能，使其成为肿瘤免疫逃逸的“帮凶”。这种双面性使得Tregs成为自身免疫病和癌症治疗领域极具吸引力的靶点。

然而，Tregs的研究与应用面临重大技术瓶颈：它们在外周血CD4⁺ T细胞中仅占5%-10%，且体外培养时易失去功能稳定性。在需要自体细胞移植（Autologous Cell Transfer, ACT）的临床前研究中，这一挑战尤为突出——单个供体小鼠所能提供的Tregs数量难以满足多个受体动物的治疗需求。此外，基因编辑操作（如CRISPR-Cas9）过程中的核转染步骤会进一步损伤细胞活力。近年来研究表明，敲除固醇受体共激活因子3（Steroid Receptor Coactivator 3, SRC-3）的Tregs在肿瘤模型中展现出显著抗肿瘤潜力，这为开发新型肿瘤免疫疗法提供了新思路。但如何高效获得足够数量的基因编辑Tregs，成为制约相关研究发展的关键技术壁垒。

针对这一难题，Baylor College of Medicine的研究团队在《Journal of Leukocyte Biology》上发表了他们的解决方案。他们以SRC-3基因敲除（Knockout, KO）小鼠Tregs为模型，系统优化了从细胞分离、基因编辑到体外扩增的全流程方案，建立了一套高效、稳定的mTregs培养体系。

关键技术方法包括：从C57BL/6J小鼠脾脏分离Tregs，通过CRISPR-Cas9核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）复合物靶向敲除NCOA3基因（编码SRC-3），比较不同细胞因子组合（IL-2、TNFα、IFNγ等）、TCR刺激时长（2天vs 7天）及培养基更换方式（离心vs轻柔移液）对细胞增殖、Foxp3表达和表型稳定性的影响。

优化培养基配方与换液方式显著提升mTregs扩增效率

研究人员首先聚焦于培养基优化。他们发现IL-2浓度与mTregs扩增效率呈正相关，最终确定1000 U/ml为最佳浓度。在比较HEPES缓冲液、β-巯基乙醇和丙酮酸钠三种常见添加剂时，HEPES缓冲液在维持pH稳定和促进细胞增殖方面表现最为突出。更具创新性的是，他们发现核转染后避免离心、采用轻柔移液换液的方式，能显著改善基因编辑Tregs的存活率和扩增能力。虽然雷帕霉素和TGFβ能提高Foxp3⁺细胞比例，但这是以牺牲整体扩增效率为代价的，因此研究者建议根据实验目的权衡使用。

肿瘤微环境细胞因子对mTregs表型与增殖的差异化调控

鉴于SRC-3 KO Tregs在肿瘤模型中表现出改变TME细胞因子谱的能力，团队进一步探究了TME常见因子（IFNγ、CXCL9、TNFα）对mTregs的影响。有趣的是，TNFα能显著促进野生型mTregs增殖，却不影响Foxp3表达水平。IFNγ虽不影响Treg增殖，但能有效抑制癌细胞生长，提示其在TME中可能发挥双重抗肿瘤作用：既促进炎症反应又直接诱导癌细胞凋亡。

延长TCR刺激时间促进mTregs扩增且揭示SRC-3在TNFα信号中的关键作用

刺激时长对比显示，延长TCR刺激至7天能显著提升mTregs扩增效率，同时上调激活标志物（CD25、CD127）和耗竭标志物（PD-1、CTLA-4）表达。当将延长刺激与TNFα处理结合时，野生型mTregs仅呈现轻微扩增增强，而SRC-3 KO mTregs则完全丧失TNFα的促增殖效应。这一发现提示SRC-3可能是TNFα信号通路的关键介质，在调控Treg增殖中扮演重要角色。

基因编辑与扩增方案的灵活性适配不同实验需求

研究还验证了实验流程的灵活性：核转染既可于TCR刺激前也可在刺激后进行，两者均能实现有效的基因敲除和细胞扩增。这种灵活性使得方案能适应不同的实验设计需求，为Treg研究提供了更多可能性。

该研究建立的优化方案成功解决了基因编辑mTregs体外扩增的技术瓶颈。通过整合高浓度IL-2、HEPES缓冲液、轻柔换液等关键改进，显著提升了SRC-3 KO mTregs的得率和活力。方案对TME细胞因子的响应分析和TCR刺激时长的优化，为理解Treg生物学提供了新见解。特别是发现SRC-3在介导TNFα促增殖信号中的关键作用，深化了我们对共激活因子调控免疫细胞功能的认识。这套标准化、可重复的操作流程为推进Treg细胞疗法的临床前研究提供了可靠技术平台，有望加速Treg相关疗法在自身免疫病和肿瘤治疗领域的转化应用。