关于CRISPR-Cas12a-Split crRNA系统在单管中依次检测DNA和RNA的研究

《Analytica Chimica Acta》：Investigation on CRISPR-Cas12a-Split crRNA System for Successively Detecting DNA and RNA in One Tube

CRISPR-Cas12a分裂crRNA实现单管同步检测HBV DNA和HIV RNA，通过分步trans-cleavage和cis-cleavage分别量化两种核酸，检测限低至0.70 pM和0.47 nM，显著简化操作流程并降低成本。

　　近年来，CRISPR/Cas系统因其简便性和高准确性而被提出为一种新型的工具，广泛应用于基因编辑和分子诊断领域。CRISPR RNA（crRNA）可以分为spacer crRNA和handle crRNA，而不会失去其原有的功能。本研究中，我们利用CRISPR Cas12a与split crRNA的结合，实现了在同一反应体系中对HBV DNA和HIV RNA的检测。这一方法不仅简化了检测流程，而且仅需使用Cas12a蛋白，避免了传统方法中需要多种Cas蛋白的复杂性。

在第一阶段，Cas12a能够识别HBV DNA，并通过其与FAM-BHQ1报告探针之间的trans-cleavage反应，产生与HBV DNA浓度相关的荧光信号。经过一小时的孵育后，荧光强度可以准确反映HBV DNA的含量。在第二阶段，我们将TAMRA BHQ2 dsDNA报告探针引入同一反应体系中，使其与剩余的Cas12a蛋白结合，同时与HIV RNA和handle crRNA相互作用。由于第一阶段的trans-cleavage不会干扰第二阶段的反应，HIV RNA可以通过cis-cleavage反应被定量检测。这种方法的检测限分别为0.70 pM（HBV DNA）和0.47 nM（HIV RNA），展示了其高度的灵敏性和特异性。

CRISPR系统的优势在于其高特异性、准确性和成本效益，使其在一些缺乏昂贵设备和专业技术人员的偏远地区也能实现快速诊断。Chen等人利用连接在非特异性ssDNA两端的荧光探针（FQ报告探针）作为检测信号，当LbCas12a-crRNA复合物识别目标HPV DNA时，通过trans-cleavage反应释放出大量荧光信号。类似地，Gootenberg等人发现Cas13a-crRNA复合物在与目标RNA孵育后，也可以激活对ssRNA FQ报告探针的trans-cleavage反应，结合RPA和T7转录技术，能够检测低至3.2 aM的ZIKV RNA。然而，这些研究仅限于检测单一的DNA或RNA目标，未能实现对多种目标的同时检测。

Cas12a蛋白在结合crRNA形成复合物后，能够精确识别互补的DNA序列，并通过trans-cleavage反应降解ssDNA报告探针，产生荧光信号。Cas13a的检测原理与Cas12a类似，但其目标为RNA。然而，在真实的生物环境中，信号输入的有限性和可编程性给CRISPR系统在多目标检测中的应用带来了挑战。同时，同时检测两种或多种疾病标志物对于疾病的诊断和管理至关重要。一方面，同时测量多种生物标志物可以显著提高诊断的准确性和特异性。例如，仅依靠总PSA水平无法可靠地区分前列腺癌和良性病变。另一方面，多重检测可以大幅提高病原体诊断的效率。在急性呼吸道感染的情况下，多重PCR检测可以在短时间内快速识别多种病原体，如流感病毒、SARS-CoV-2等。

传统的CRISPR检测方法在检测多目标时存在一定的局限性。一方面，Cas12a蛋白更倾向于降解DNA底物，而非RNA底物，这限制了其在RNA检测中的应用。另一方面，Cas蛋白的trans-cleavage特性会导致其对非目标的FQ报告探针产生非特异性降解，影响检测的准确性。为了解决这一问题，Tang等人将CRISPR Cas12和Cas13与量子点（QDs）报告探针结合，实现了在同一激发波长下对H1N1 DNA和SARS-CoV-2 RNA的同时检测。然而，QDs中的Cd2+可能对Cas蛋白产生干扰，影响信号与噪声的比例。Kellner等人开发了一个四通道系统，结合四种不同的Cas蛋白，通过其对寡核苷酸FQ报告探针的trans-cleavage偏好，实现对多种DNA和RNA目标的区分。但这种方法存在不同Cas蛋白之间trans-cleavage反应相互干扰的问题。Xu等人设计了一种微流控装置，结合CRISPR和RPA技术，通过空间位置或空间编码的方式，使用单一FQ报告探针区分多种目标信号。然而，由于编码技术的复杂性和芯片制造的难度，这种检测方法仍然面临成本高和操作复杂的问题。

为了克服传统方法的不足，本研究提出了一种仅使用Cas12a蛋白的单管检测方法，能够依次检测DNA和RNA。通过split crRNA的设计，我们首先利用Cas12a与spacer crRNA和handle crRNA的结合，对HBV DNA进行trans-cleavage检测，从而实现对其的定量分析。随后，通过引入中性标记的DNA激活剂，Cas12a能够通过cis-cleavage反应检测HIV RNA。这种方法的主要优势在于，通过灵活利用Cas12a的trans-和cis-cleavage特性，可以有效消除因多种目标共存而产生的杂乱荧光信号。此外，仅使用Cas12a蛋白结合单一的handle RNA和不同的spacer RNA，能够显著降低成本并简化操作流程。

split crRNA系统还展示了其在同时识别和半定量两种DNA目标方面的强大能力。传统方法中，由于Cas蛋白的trans-cleavage特性，很难区分DNA和RNA，而split crRNA的引入使得这一问题得到了解决。通过将完整的crRNA分为spacer crRNA和handle crRNA，我们能够实现对DNA和RNA的分别检测。这一设计不仅提高了检测的灵活性，还拓展了Cas12a的应用范围。例如，Xia等人发现，通过引入miRNA、handle crRNA和DNA激活剂，Cas12系统可以突破其固有的限制，直接检测RNA。

在本研究中，我们不仅实现了对HBV DNA和HIV RNA的单管检测，还展示了其在多重DNA检测中的潜力。通过将不同的spacer RNA与单一的handle RNA结合，split crRNA系统能够识别并半定量两种DNA目标。这一方法在不需要额外的Cas蛋白的情况下，实现了对多种目标的检测，从而降低了检测成本，提高了操作的便捷性。此外，该方法在实际应用中表现出良好的稳定性和重复性，为现场快速诊断提供了新的思路。

总的来说，本研究提出了一种基于Cas12a蛋白和split crRNA的单管检测方法，成功克服了传统CRISPR方法在多重目标检测中的局限性。通过将检测过程分为两个阶段，分别利用trans-cleavage和cis-cleavage反应，实现了对DNA和RNA的依次检测。这种方法不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还显著降低了成本，简化了操作流程，使得CRISPR技术在实际应用中更加可行。未来，该方法有望在疾病诊断、公共卫生监测和快速筛查等领域得到广泛应用，为实现低成本、高效率的分子诊断提供了新的解决方案。