反义寡核苷酸脑内递送改善DMD模型小鼠焦虑行为的研究

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Behavioral improvement in dystrophic mdx23 mouse following repeated antisense oligonucleotides injections

本研究针对杜氏肌营养不良症（DMD）患者中常见的神经行为共病（如焦虑、恐惧反应增强），通过脑池内注射磷酸二胺吗啉寡聚物（PMO）诱导外显子23跳跃，在mdx23小鼠模型中实现了脑部肌营养不良蛋白（dystrophin）的低水平恢复。研究发现，尽管蛋白恢复水平有限（最高达10%），但治疗组小鼠在高架十字迷宫（EZM）测试中表现出焦虑行为的显著改善，且小脑区dystrophin恢复水平与行为改善呈正相关。这表明 postnatal 时期恢复脑内dystrophin表达可能缓解DMD相关神经行为症状，为开发靶向中枢神经系统的DMD治疗策略提供了实验依据。

　　

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种由DMD基因突变引起的严重神经肌肉疾病，患者不仅出现进行性肌肉萎缩，还常伴有焦虑、自闭症谱系障碍等神经行为共病。这些症状与大脑中多种肌营养不良蛋白（dystrophin）亚型的缺失密切相关，尤其是全长亚型Dp427的缺乏。然而，目前获批的核酸疗法主要针对肌肉症状，由于无法穿透血脑屏障（blood-brain barrier, BBB），对中枢神经系统（central nervous system, CNS）症状无改善作用。因此，如何有效将治疗性寡核苷酸递送至脑内，并评估其对行为表型的挽救效果，成为DMD治疗研究的重要挑战。

在此背景下，Artadokht Aghaeipour、Manuela Mitsogiannis等研究人员在《Molecular Therapy Nucleic Acids》上发表论文，探讨了通过脑池内（intracisterna magna, ICM）注射反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）能否在mdx23小鼠脑内诱导外显子跳跃、恢复dystrophin表达，并改善其焦虑样行为。

研究团队主要采用了以下关键技术方法：通过脑池内注射方式向6周龄mdx23小鼠递送PMO ASO（总剂量2.7 mg）；使用定量PCR（qPCR）和简单西方 blot（WES）技术分别检测不同脑区的外显子跳跃效率和dystrophin蛋白恢复水平；通过免疫组化（IHC）观察小脑浦肯野细胞中dystrophin的定位；并运用一系列行为学测试（包括旷场实验、高架十字迷宫、明暗箱、被动回避等）评估小鼠的焦虑、恐惧和认知功能。

急性应激增加mdx23小鼠的不动时间，但24小时内完全恢复

研究人员首先通过短期束缚应激实验发现，mdx23小鼠在束缚后立即表现出更长的静止时间、更短的活动时间和更短的移动距离，但与野生型（wild-type, WT）小鼠相比，其在6小时和24小时后均能完全恢复运动活动水平。这表明mdx23小鼠对急性应激有增强的恐惧反应，但恢复能力未受损。

每日束缚应激升高mdx23小鼠的焦虑样行为

在持续7天的旷场测试中，mdx23小鼠在束缚后表现出比WT小鼠更长的静止时间、更短的中央区停留时间和更短的移动距离，且这种差异在应激处理组中更为明显。在高架十字迷宫和明暗箱测试中，mdx23小鼠的开放区域探索行为减少，表明其基础焦虑水平较高。然而，在被动回避、三室社交互动和T迷宫延迟交替测试中，基因型间未见显著差异，提示mdx23小鼠的空间和社会认知功能可能未受明显影响。

WT小鼠不同脑区全长dystrophin亚型的基因表达

通过qPCR分析发现，Dp427c亚型在WT小鼠所有脑区中表达最高，而Dp427p1和Dp427p2仅在小脑中检测到。Dp427m（肌肉主要亚型）也在多个脑区表达，这在以往研究中未见报道。蛋白水平检测显示，各脑区Dp427蛋白量无显著差异，但后脑和颈脊髓有降低趋势。

PMO治疗小鼠在注射后7周EZM焦虑行为显著改善

脑池内注射PMO后，mdx23小鼠在治疗5周时小脑区外显子跳跃效率最高（约20%），蛋白恢复在嗅球区最显著（约10%）。至7周时，蛋白恢复水平有所下降，但治疗组小鼠在高架十字迷宫测试中表现出开放区域停留时间的显著增加（手动评分），且小脑区dystrophin恢复水平与开放区域停留时间呈正相关。其他参数如进入开放区域的潜伏期、伸展-注视姿势次数等也显示治疗组行为介于WT和未治疗mdx23小鼠之间。

PMO治疗小鼠在5周和7周后dystrophin蛋白和外显子23跳跃恢复

WES和IHC结果显示，PMO注射后5周，小脑浦肯野细胞中可见dystrophin蛋白恢复；至7周时，仅部分动物仍能检测到蛋白表达。此外，治疗组小鼠小脑中β-肌营养不良蛋白聚糖（β-dystroglycan）和β-肌营养不良蛋白（β-dystrobrevin）水平与WT无异，提示dystrophin相关蛋白复合物（dystrophin-associated protein complex, DAPC）可能得到部分恢复。

本研究首次证实了通过脑池内注射PMO可在mdx23小鼠多个脑区诱导低水平dystrophin恢复，并显著改善其焦虑样行为。尽管蛋白恢复效率有限，但行为学改善表明，即使少量dystrophin也可能对神经功能产生积极影响。这一发现为开发能够靶向CNS的DMD治疗策略提供了重要依据，并提示高架十字迷宫和无条件恐惧反应测试可作为临床前评估脑内dystrophin恢复疗效的可靠指标。未来研究可进一步优化ASO的递送效率和稳定性，以期为DMD患者神经行为共病的治疗开辟新途径。