RGS蛋白通过调控G蛋白信号通路决定小鼠黑视蛋白在ipRGC亚型中的差异性光转导

《Biophysical Journal》：RGS Proteins: Potential Regulators of Mouse Melanopsin's Signaling Phototransduction Cascade Across ipRGC Subtypes

本研究聚焦于黑视蛋白这一GPCR如何在不同ipRGC亚型中启动差异性光转导通路这一关键科学问题。研究人员通过单细胞转录组分析、RNA原位杂交及BRET等关键技术，发现M1与M4 ipRGC亚型特异性富集不同的RGS蛋白。研究证实RGS蛋白通过差异性调控Gαi/o与Gαq信号通路，决定了cAMP信号在M4亚型中的主导地位，揭示了GPCR系统偏见的全新调控机制，为理解单一受体在不同细胞环境中产生多样化功能提供了重要理论依据。

　　

在我们眼睛的视网膜深处，存在着一群特殊的神经元——本质光敏视网膜神经节细胞（ipRGCs）。它们不依赖于传统的视杆和视锥细胞，自身就能感知光线，负责调控人体的生物钟、瞳孔对光反射等重要非成像视觉功能。这群细胞的神奇之处在于它们表达的唯一光敏色素——黑视蛋白（melanopsin），这是一种G蛋白偶联受体（GPCR）。

长期以来，科学界认为所有ipRGCs都使用相同的信号传导路径：光激活黑视蛋白，进而激活Gα_q蛋白，通过PLCβ4打开TRPC6/7通道，导致细胞去极化。然而，近年来的研究发现了一个令人困惑的现象：虽然所有六种ipRGC亚型（M1-M6）都表达黑视蛋白并使用Gα_q信号，但它们的信号传导路径却存在显著差异。特别是在M4亚型中，光反应在TRPC6/7基因敲除小鼠中依然存在，表明存在替代性的光转导机制。有研究指出M4 ipRGCs可能通过环磷酸腺苷（cAMP）介导的机制产生光反应，这与M1亚型的经典路径截然不同。

这一现象引出了一个核心科学问题：同一个GPCR（黑视蛋白）是如何在不同细胞类型（ipRGC亚型）中启动截然不同的信号传导级联反应的？这就是GPCR研究中的重要概念——"系统偏见"，即细胞特有的蛋白质组能够塑造GPCR的信号输出结果。

为了解开这个谜团，由Lee Harkless、Km Daly等研究人员组成的团队在《Biophysical Journal》上发表了一项重要研究。他们发现，不同ipRGC亚型中特异性表达的RGS蛋白（G蛋白信号调节因子）可能是决定黑视蛋白信号偏向性的关键分子。

研究人员主要运用了几项关键技术：通过单细胞RNA测序数据的再分析和RNAscope原位杂交技术，在组织切片水平精确解析了不同ipRGC亚型中RGS基因的表达模式；利用BRET（生物发光共振能量转移）技术，在HEK293细胞异源表达体系中系统评估了黑视蛋白与12种不同Gα亚基的耦合能力，以及各种RGS蛋白对其信号输出的调节作用；采用GloSensor cAMP测定法检测黑视蛋白激活后的cAMP动态变化；通过病毒介导的DREADD（仅由设计药物激活的设计受体）技术在原生ipRGCs中进行化学遗传学实验，验证cAMP信号通路的功能性作用。

ipRGC亚型表现出不同的RGS基因表达模式

研究人员首先通过分析已发表的小鼠视网膜单细胞转录组数据，发现不同的ipRGC亚型确实具有独特的RGS蛋白表达谱。M1亚型的一个亚群特异性富集Rgs16，而M4亚型则优先表达Rgs5和Rgs11。普遍表达的Rgs4和Rgs17在所有亚型中都有发现。这种差异性的表达模式随后通过RNAscope原位杂交技术在视网膜切片上得到了验证，确认了M4 ipRGCs中Rgs5和Rgs11的高表达，以及部分M1细胞中Rgs16的特异性表达。

小鼠黑视蛋白是一个多能性的GPCR，可激活所有四种G蛋白家族

为了建立基准参照，研究团队在G蛋白缺陷的HEK293细胞中系统评估了黑视蛋白的G蛋白耦合谱。令人惊讶的是，黑视蛋白表现出了广泛的多能性，能够激活所有四种G蛋白家族（Gα_q/11、Gα_i/o、Gα_s/olf和Gα_12/13），其中对Gα_q/11家族成员显示出最强的偏好性，同时对Gα_i/o家族也产生稳健的激活作用。这一发现表明黑视蛋白本身具有启动多种信号通路的潜力。

黑视蛋白信号传导受到RGS蛋白的差异性调节

接下来，研究人员测试了四种RGS蛋白（RGS4、RGS5、RGS16、RGS17）对黑视蛋白信号输出的调节作用。结果显示，这些RGS蛋白对不同的G蛋白通路具有显著的选择性。特别值得注意的是，在M4亚型中富集的RGS5对Gα_i/o信号表现出强烈的选择性抑制，而对Gα_q/11的影响相对较小。这种选择性调节可能导致在M4细胞中，Gα_i/o信号通路被有效抑制，从而改变黑视蛋白信号的平衡。

黑视蛋白通过Gq-Gβγ机制动员cAMP

由于先前研究提示cAMP可能在M4 ipRGCs的光转导中发挥作用，研究团队探索了黑视蛋白激活如何导致cAMP产生。实验结果表明，黑视蛋白确实能够引起cAMP水平升高，但这一效应完全依赖于Gα_q激活后释放的Gβγ亚基，而不是通过传统的Gα_s通路。当使用masGRK3ct（一种Gβγ清除剂）时，cAMP反应被完全抑制，证实了Gβγ的关键作用。

cAMP升高足以驱动M1和M4 ipRGCs产生动作电位

通过化学遗传学方法，研究人员在原生ipRGCs中表达了DREADD-Gs（特异性激活Gα_s信号的设计受体），发现激活cAMP通路确实能够在M1和M4 ipRGCs中都引发动作电位。这一发现挑战了先前认为M1细胞对cAMP不敏感的观点，表明两种亚型都具备cAMP依赖性兴奋所需的分子机制。

RGS蛋白组合模拟ipRGC亚型环境

最后，研究团队在异源表达系统中模拟了M1样（RGS4/16/17）和M4样（RGS4/5/17）的RGS蛋白组合。结果显示，M4样的RGS组合显著抑制了Gα_i/o信号，同时相对保留了Gα_q信号，这与研究提出的模型一致：M4细胞中Gα_i/o选择性RGS蛋白的表达会削弱Gα_i/o信号，从而增强由Gα_q-Gβγ驱动的cAMP通路。

研究结论和讨论部分强调，这项工作揭示了一种新型的"系统偏见"机制，通过这种机制，ipRGC亚型特异性的RGS蛋白表达谱能够塑造黑视蛋白的信号输出。在M1 ipRGCs中，RGS16表达的变异性可能贡献于该群体内部光敏感性的差异。而在M4 ipRGCs中，多种Gα_i/o选择性RGS蛋白（Rgs5、Rgs11以及高表达的Rgs4）的富集，会减弱Gα_i/o信号，解除对腺苷酸环化酶的抑制，从而增强cAMP信号。

这一机制解释了单一GPCR如何在不同细胞类型中产生差异性的信号输出，不仅增进了我们对视觉系统的基本理解，也为靶向GPCR信号通路的药物开发提供了新思路。由于RGS蛋白在全身各种组织和细胞类型中广泛表达，这种调控机制可能具有普遍意义，代表了精细调节GPCR功能的一种普遍策略。