StealTHY：免疫原性无CRISPR平台揭示免疫健全模型中隐藏的转移调控因子及其临床意义

《Cell》：StealTHY: An immunogen-free CRISPR platform to expose concealed metastasis regulators in immunocompetent models

本研究针对传统CRISPR-Cas9工具在免疫健全模型中因细菌核酸酶免疫原性导致实验偏差的难题，开发了免疫原性消除的StealTHY平台。通过采用自体同源报告基因Thy1替代异源标记，结合"hit-and-run"式CRISPR敲除策略，在免疫健全小鼠和人源化模型中成功揭示了AMH-AMHR2轴作为先前未被认识的转移驱动通路。该研究不仅解决了CRISPR筛选在免疫活性环境中的技术瓶颈，更为发现癌症转移的免疫依赖性调控机制提供了全新视角，对开发针对转移过程的免疫治疗策略具有重要转化价值。

　　

癌症转移是一个复杂的多步骤过程，涉及肿瘤细胞与免疫系统的动态相互作用。尽管CRISPR-Cas9基因编辑技术已成为功能基因组学研究的重要工具，但在免疫健全动物模型中的应用却面临重大挑战。细菌来源的Cas9核酸酶和常用的抗性标记（如Puromycin Resistance）具有强烈的免疫原性，会导致工程化肿瘤细胞被免疫系统清除，从而扭曲体内筛选结果，掩盖真实的基因功能。

为了解决这一根本性技术限制，研究人员开发了StealTHY平台——一种免疫原性消除的CRISPR筛选系统。该平台的核心创新在于使用自体同源细胞表面标记物Thy1（CD90）替代传统的异源报告基因，并通过"hit-and-run"策略瞬时递送Cas9蛋白，在体内筛选前完成基因敲除，从而避免外源蛋白的长期表达引发的免疫反应。

研究团队首先在小鼠同源肿瘤模型（包括MVT1、4T1和Py2T乳腺癌模型）中证实，传统CRISPR工具会引起强烈的T细胞介导的免疫编辑，导致克隆丢失和转移抑制。通过设计包含2000多个sgRNA的文库，他们发现使用Thy1标记的文库能保持更高的克隆复杂性，而使用传统PuroR标记的文库则出现显著的克隆偏差。

应用StealTHY平台进行体内筛选，研究人员发现了多个与转移相关的基因通路，其中最显著的是抗穆勒氏管激素（AMH）及其受体AMHR2信号轴。该通路在多个癌症模型中被鉴定为转移驱动因子，其敲除能显著抑制转移并改善生存率。机制研究表明，AMH-AMHR2信号通过调节TGF-β/SMAD和IFN-STAT1通路，影响上皮-间质转化（EMT）和免疫微环境的重编程。

在人源化小鼠模型中，StealTHY平台成功识别出与临床预后相关的转移调控因子。TCGA数据分析进一步证实，AMH高表达与乳腺癌、肺癌和结肠癌患者的不良预后显著相关，而AMH低表达特征则与更好的生存结果相关。

研究采用的主要技术方法包括：自体同源报告系统构建（使用鼠源Thy1和人源THY1变体）、CRISPR文库构建与筛选（>2000个sgRNA）、瞬时Cas9蛋白递送、人源化小鼠模型（使用HLA匹配的脐带血造血干细胞移植）、多参数流式细胞术、单细胞RNA测序（使用SMARTer低输入量建库技术）和体内外功能验证实验。

研究结果表明，免疫原性消除的StealTHY平台能够：1）在免疫健全宿主中保持CRISPR文库的克隆复杂性；2）揭示传统方法无法检测到的转移调控基因；3）鉴定AMH-AMHR2作为关键的转移促进通路；4）证明该通路的临床相关性及其作为治疗靶点的潜力。

最重要的发现是AMH-AMHR2信号轴在癌症转移中的重要作用。研究人员发现，在多种癌症模型中，AMHR2的敲除或使用显性阴性受体变体（AMHR2△）能够显著抑制转移过程，这种效应依赖于完整的免疫系统。机制上，AMH-AMHR2信号通过调节SMAD1/5和SMAD2/3的活性，影响TGF-β信号通路，进而调控上皮-间质转化和干扰素反应。值得注意的是，这种调控具有免疫环境依赖性，在免疫缺陷小鼠中不明显，但在免疫健全宿主中效果显著。

研究还发现，AMH-AMHR2信号影响肿瘤免疫微环境。AMHR2抑制后，肿瘤中CD4⁺和CD8⁺T细胞浸润增加，Treg细胞减少，同时STAT1磷酸化水平升高，表明免疫反应被激活。这些变化可能与干扰素信号通路的增强有关，为联合免疫治疗提供了理论基础。

临床意义方面，TCGA数据分析显示，AMH高表达与多种癌症的不良预后相关，而AMH低表达特征则与较好的生存结果相关。这表明AMH-AMHR2信号轴可能成为新的治疗靶点，特别是针对转移过程。

研究的讨论部分强调，StealTHY平台不仅解决了CRISPR筛选在免疫健全模型中的技术难题，更重要的是提供了一个能够真实反映肿瘤-免疫相互作用的研究工具。这项工作揭示了免疫系统在塑造肿瘤克隆进化中的关键作用，以及如何利用这一知识发现新的治疗靶点。

值得注意的是，该研究还发现不同癌症模型对CRISPR工具的免疫原性敏感度存在差异，这与模型的免疫特征和抗原呈递能力有关。这种差异进一步强调了在免疫健全环境中进行功能基因组学研究的重要性。

研究的局限性包括主要在上皮源性癌症模型中验证平台，而在非上皮源性癌症中的应用仍需进一步探索。此外，虽然使用了人源化小鼠模型，但HLA匹配程度仍不如患者来源的异种移植（PDX）模型。

总体而言，这项研究通过开发创新的实验平台，解决了癌症研究中的一个重要技术挑战，揭示了先前被隐藏的转移调控机制，为理解癌症转移的免疫生物学提供了新的见解，并为开发针对转移过程的治疗策略奠定了基础。研究人员提出的免疫原性消除策略不仅适用于癌症研究，还可能扩展到自身免疫疾病、细胞治疗和基因治疗等领域。