基于T2C CNN的单染料单分子结合事件分类方法突破衍射极限荧光成像瓶颈

《Nature Communications》：Discriminating single-molecule binding events from diffraction-limited fluorescence

本研究针对单分子定位显微镜中区分不同结合类型需依赖多染料、时间分割或耗时动力学分析等传统方法的局限性，开发了Temporal-to-Context卷积神经网络（T2C CNN），能够仅使用单一荧光染料从衍射极限荧光斑点中同步分类单个结合事件。该方法在DNA-PAINT实验中实现高达94.76%的分类准确率，将观测时间从数分钟缩短至数秒，为高通量单分子成像提供了新范式。

　　

在生命科学领域，单分子定位显微镜（SMLM）技术革命性地推动了纳米尺度生物系统的可视化，然而区分不同分子结合类型一直面临重大挑战。传统方法如使用不同荧光染料、时间分割技术或动力学分析存在实验设计复杂、潜在光毒性、染料串扰、异步问题以及需要长时间观测等局限性，严重限制了其在活细胞成像和实时成像中的应用。

近日发表在《Nature Communications》的研究突破性发现，衍射极限荧光斑点中蕴含了以往被忽视的时空信息，能够用于区分不同的结合类型。基于这一发现，研究团队开发了Temporal-to-Context卷积神经网络（T2C CNN），该网络通过整合长期空间卷积、浅层交叉连接块和无池化结构，在保留细粒度时间特征的同时增强了上下文表征能力。

研究人员主要采用了DNA-PAINT（点积累纳米级拓扑成像）技术，在DNA折纸和HER2阳性细胞样本上进行实验验证。关键技术方法包括：通过TIRF显微镜采集荧光视频数据，使用Picasso软件进行斑点定位和结合事件提取，构建T2C CNN模型进行结合类型分类，并采用五折交叉验证评估模型性能。

结合类型信息在衍射极限荧光斑点中的发现

研究发现，除了结合时间外，衍射极限荧光斑点还包含丰富的结合类型信息。通过分析25，530个结合事件，发现帧间相关性模式和常见统计特征（如总和特征、非零特征、非掩膜特征）与结合类型存在显著相关性，相关系数最高可达0.5。

跨实验评估现有方法的性能

在DNA折纸实验中，传统基于结合时间的概率密度函数（PDF）方法仅能达到约75%的准确率，而T2C CNN在仅5秒的观测时间内即可实现约95%的准确率，显著优于3D ResNet-18、Video Transformer等先进视频分类模型。

多类实验验证

研究还将方法扩展到三分类任务，引入6nt-6nt R1链结合类型，T2C CNN同样表现出色，为多靶点超分辨率成像提供了可靠工具。

T2C CNN的可解释性分析

通过显著性映射发现，衍射极限荧光斑点的边缘区域对模型预测贡献最大，这些区域包含的衍射模式差异是区分结合类型的关键。同时，模型对不同时间段的重要性分析表明，结合早期阶段的信息对分类尤为重要。

图像基结合类型分类模型的鲁棒性测试

在模拟泊松噪声、高斯噪声和热像素噪声等常见干扰条件下，T2C CNN表现出最强的鲁棒性，特别是在处理泊松和高斯噪声方面表现优异。

HER2靶向细胞实验

在更复杂的细胞环境中，T2C CNN仍能保持78.48-80.61%的分类准确率，显著优于其他对比模型，证明了其在真实生物样本中的适用性。

研究结论表明，T2C CNN通过有效提取衍射极限荧光斑点中的时空信息，实现了单一荧光染料下的高精度结合类型分类。该方法不仅显著提高了分类准确率，还大幅缩短了观测时间，为单分子荧光成像技术在实时、高通量应用场景中的发展开辟了新途径。特别值得注意的是，该方法在复杂细胞环境中的良好表现，为其在生物医学研究中的实际应用奠定了坚实基础。

讨论部分进一步指出，该方法可扩展到更多结合类型的区分，并为探索更广泛分子结合事件对荧光的影响提供了新思路。尽管在复杂细胞成像场景中仍存在一些挑战，但T2C CNN的创新架构设计为荧光视频处理提供了宝贵见解，有望推动单分子成像技术向更高通量、更高效率的方向发展。