为表征蟑螂（Rhyparobia maderae）生物钟中的神经肽谱，对其进行了转录组学和神经肽组学研究

《Journal of Rare Earths》：Transcriptomics and Neuropeptidomics of the Cockroach Rhyparobia maderae to Characterize the Neuropeptide Landscape of the Cockroach’s Circadian Clock

生物钟研究 | Madeira蟑螂的神经肽组学鉴定及质谱分析揭示166种成熟神经肽，其中155种为首次发现，为解析昼夜节律调控机制奠定基础。

　　本研究探讨了Rhyparobia maderae（Madeira蟑螂）的昼夜节律系统，特别是其位于脑部视叶中的辅助髓质（AME）中的神经肽组成。这一发现对于理解昆虫与哺乳动物在昼夜节律调控机制上的相似性与差异性具有重要意义。通过结合转录组分析和多种质谱技术，研究人员首次全面揭示了该蟑螂的昼夜节律神经肽组，并为进一步的功能研究奠定了基础。

### 昼夜节律与神经肽的关系

在昆虫中，昼夜节律系统通常由特定的神经元网络调控，这些神经元能够响应环境中的光暗周期，从而调节生理和行为节律。在Rhyparobia maderae中，其昼夜节律控制中枢被确定为AME，这一脑区受到大约240个神经元的支配。这些神经元释放的神经肽在调节蟑螂的休息-活动周期中起着关键作用。此外，AME与视觉系统以及位于中脑的下游昼夜节律细胞紧密相连，这些细胞又连接到运动和激素释放相关的神经回路。

神经肽在节律调控中的作用主要体现在其作为信号分子，通过激活特定的受体来影响神经元活动和生理功能。例如，已知的色素分散因子（PDF）在多种昆虫中被发现能够调控睡眠-觉醒节律。而在Rhyparobia maderae中，除了PDF外，还有许多其他神经肽可能参与这一过程。这些神经肽的种类和功能尚不完全清楚，因此需要系统性的研究来揭示其具体作用。

### 转录组与神经肽预测

为了识别与昼夜节律相关的神经肽，研究人员首先对Rhyparobia maderae的转录组进行了分析。他们从不同时间点（Zeitgeber时间，ZT）收集了样本，包括脑组织、Malpighian管和触角，以确保能够涵盖不同生理状态下的基因表达情况。通过比对已知昆虫神经肽前体基因，研究人员鉴定了68个Rhyparobia maderae的神经肽、神经肽样和蛋白质激素前体基因。这些基因涵盖了多种已知的神经肽类型，如脂肪分解激素（AKH）、所有at抑制素（AT）、类胰岛素肽（ILP）、冠状肽（Crz）、促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）样激素（DH-46）等。

值得注意的是，部分基因的前体序列在N端缺失，这可能影响其成熟肽的生成和功能。此外，一些基因表现出替代剪接现象，这可能意味着它们在不同组织或不同时间点产生不同的神经肽产物。例如，AKH基因的两个转录本编码相同的成熟肽，但其前体肽序列存在差异。这种替代剪接在昆虫中较为常见，但其具体生物学意义仍需进一步研究。

### 神经肽组的鉴定与分析

为了更精确地确定这些神经肽在体内的实际存在形式，研究人员采用了多种质谱技术，包括Q-Exactive Orbitrap质谱（MS）和直接组织质谱分析（MALDI-TOF/TOF MS）。这些技术能够检测到多种神经肽及其前体，并通过质谱数据的分析来确认其结构和功能。

通过Q-Exactive Orbitrap MS，研究人员在脑和后脑复合体（RCC）中检测到了192种成熟的神经肽，其中155种是首次被发现，而另外57种则为已知的前体肽。在这些神经肽中，有166种与AME相关，表明该区域在节律调控中扮演着核心角色。同时，研究还发现一些神经肽在特定组织中具有较高的表达水平，如胸腹神经分泌器官（PSO）中的某些肽。

为了验证这些神经肽的分布和功能，研究人员还进行了免疫组化分析。例如，通过使用抗proctolin血清，他们确认了proctolin在AME中的存在，并发现其可能在调控节律过程中起作用。这一发现为后续的功能研究提供了重要依据。

### 神经肽的结构与修饰

神经肽的结构多样性与其功能密切相关。研究发现，这些神经肽可能经历多种后翻译修饰（PTMs），包括C端酰胺化、N端环化、二硫键形成、硫酸化等。这些修饰不仅影响神经肽的稳定性，还可能改变其与受体的结合能力。例如，一些神经肽的C端可能被酰胺化，而另一些则可能形成二硫键，这些结构特征可能对其在不同组织中的作用产生重要影响。

此外，一些神经肽可能具有多个变体，例如某些MIP（所有at抑制素）和NPF（神经肽F）基因可能编码不同的肽序列。这种多样性使得研究人员能够更全面地理解神经肽在节律调控中的作用，同时也为未来的药物开发提供了新的思路。

### 神经肽的功能研究

神经肽在节律调控中的作用不仅限于简单的信号传递，还可能涉及复杂的神经网络调控。例如，一些神经肽可能同时作为神经递质和神经调质，从而影响不同神经元之间的通信。此外，某些神经肽可能与激素释放相关，通过调节内分泌系统来影响节律。

研究还发现，某些神经肽可能在不同的ZT时间点具有不同的表达水平，这表明它们在节律调控中可能具有时间依赖性。这种动态变化可能与蟑螂在不同光照条件下的行为调整有关。因此，进一步研究这些神经肽在不同时间点的表达和功能，将有助于揭示其在节律调控中的具体作用。

### 神经肽与行为调节

神经肽不仅在生理节律中起作用，还可能影响昆虫的行为模式。例如，一些神经肽可能通过调节运动神经元的活动来影响蟑螂的活动节律。此外，神经肽还可能与其他神经信号分子相互作用，形成复杂的调控网络。这种网络可能在蟑螂的适应性行为中发挥关键作用，如觅食、交配和逃避危险等。

### 未来研究方向

本研究的成果为未来的神经肽功能研究提供了重要的数据支持。接下来的研究可以集中在以下方面：

1. **神经肽的功能验证**：通过功能实验，进一步确认这些神经肽在节律调控中的具体作用。例如，可以使用基因敲除或过表达技术来研究特定神经肽对蟑螂行为的影响。

2. **神经肽的时空分布**：结合免疫组化和活体成像技术，研究这些神经肽在不同ZT时间点的分布和动态变化，从而揭示其在节律调控中的时间依赖性。

3. **神经肽与神经网络的相互作用**：通过电生理实验和神经网络建模，研究这些神经肽如何影响不同神经元之间的通信和节律同步。

4. **神经肽在疾病中的作用**：由于神经肽与多种神经系统疾病相关，如慢性疼痛、情绪障碍、神经退行性疾病和癌症，研究其在这些疾病中的作用可能为人类疾病的治疗提供新的思路。

### 结论

本研究首次系统性地揭示了Rhyparobia maderae的昼夜节律神经肽组，为理解昆虫昼夜节律调控机制提供了重要的数据支持。这些神经肽不仅在节律调控中起关键作用，还可能与其他生理和行为过程相互关联。未来的研究将集中在这些神经肽的具体功能、时空分布及其在神经网络中的作用，以进一步揭示它们在调控节律中的机制。此外，这些发现也可能为人类昼夜节律相关疾病的治疗提供新的研究方向。