通过酶法修饰阴离子糖链，以微阵列的形式表征凝集素和抗体的特异性

《Journal of Biological Chemistry》：Enzymatic tailoring of anionic glycans for characterising lectin and antibody specificities in a microarray format

糖基微阵列研究揭示多种lectins和抗体对含神经氨酸、硫酸化及糖苷结构的糖复合物特异性，发现L2抗-HNK-1无需硫酸盐即可识别β1-3Galβ1-4GlcNAc，HECA-452仅与Neu5Ac结合，Siglecs对神经氨酸类型有偏好。

　　### 糖链与蛋白质相互作用的深入研究：揭示糖基化模式和诊断应用的潜力

糖链作为生物体内重要的分子识别标记，在免疫系统、细胞信号传递以及疾病发生过程中发挥着关键作用。随着对糖生物学研究的不断深入，科学家们逐渐认识到，许多传统方法在分析糖链与糖结合蛋白（如凝集素、抗体）之间的相互作用时存在局限性。例如，已知的商业凝集素和糖结合蛋白虽然在某些糖链结构上表现出预期的识别能力，但在特定情况下仍可能显示出意外的特异性，这种现象提示我们有必要对这些糖链结构的识别机制进行更细致的重新研究。这种研究不仅有助于更准确地理解糖链的功能，还可能在疾病诊断和治疗中发挥重要作用，特别是在快速筛选糖基化模式和诊断性组织化学方面。

为了克服传统方法的不足，本研究构建了一个包含多种天然阴离子糖链的微阵列。该微阵列不仅涵盖了常见的N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）和N-羟乙基神经氨酸（Neu5Gc），还包含了硫酸化半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖酸等结构。此外，我们还对比了线性四糖与典型的双抗原N-糖链核心结构在结合模式和信号强度方面的差异。这一扩展的糖链库提供了更为全面的阴离子糖链结构，并揭示了一些常被忽视的糖链特异性，如N-羟乙基神经氨酸的识别能力，为相关研究提供了新的视角。

通过使用重组的糖基转移酶和硫酸转移酶，我们能够高效合成这些糖链，并利用荧光标记技术（如2-氨基-N-(2-氨基乙基)苯甲酰胺，AEAB）进行标记。这些糖链随后被用于与多种植物凝集素、C型凝集素、神经氨酸特异性凝集素、抗体（如抗NeuGc抗体和抗Le^X抗体）以及一些重组原核凝集素（RPLs）进行结合分析。研究结果显示，某些蛋白质表现出更狭窄的特异性，例如L2抗HNK-1仅识别特定的糖链结构，即使没有硫酸化修饰，也能有效结合线性糖链。这表明，一些糖链修饰可能在某些情况下并不必要，而某些抗体则能识别多种糖链结构，包括α2,3连接的神经氨酸和神经氨酸的修饰形式，这种识别能力为相关糖链的检测提供了新的可能性。

此外，本研究还探讨了抗CLA抗体（HECA-452）对不同糖链的识别情况。该抗体能够识别唾液酸化的Le^X和Le^A表位，但对Neu5Gc的识别能力较弱，且对糖链的结构有特定要求，例如必须存在岩藻糖修饰。这一发现有助于更精确地理解抗CLA抗体在疾病诊断中的应用潜力，尤其是在皮肤癌和免疫反应中的作用。同时，我们还发现某些糖链修饰可能会影响糖链与特定蛋白质的结合能力，例如6-硫酸化半乳糖对某些凝集素的结合产生抑制作用，而其他修饰则可能增强结合信号。

研究还特别关注了某些糖链修饰对糖链识别的影响。例如，HECA-452抗体能够识别含有α2,3连接的神经氨酸的糖链，但对含有6-硫酸化半乳糖的糖链无响应。这提示我们，某些糖链修饰可能在特定蛋白质的识别过程中起到关键作用。同样，我们发现抗Le^A抗体（T174）对不同类型的神经氨酸修饰（Neu5Ac和Neu5Gc）表现出相似的结合能力，这表明其识别模式可能更加广泛，而非局限于特定的糖链类型。这种发现为相关糖链的检测提供了新的思路，并可能在临床诊断中具有重要应用价值。

本研究还涉及了多个糖链修饰的结合模式分析。例如，WGA（小麦胚芽凝集素）仅识别α2,3连接的Neu5Ac，而对Neu5Gc无响应。这表明WGA可能在某些生物系统中具有特定的识别偏好。另一方面，某些抗原识别能力可能受到糖链结构的显著影响，如抗Le^X抗体（L5）仅识别未被唾液酸化的Le^X表位，而抗Le^A抗体（T174）则能够识别唾液酸化的Le^A表位。这种差异提示我们，在设计糖链微阵列时，需要考虑到不同糖链修饰对蛋白质识别能力的影响。

在糖链修饰方面，研究还揭示了一些有趣的现象。例如，FUT3（岩藻糖转移酶3）在某些情况下可能优先将岩藻糖转移到葡萄糖而不是N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc），这与传统的糖链修饰机制有所不同。此外，某些糖链结构的结合能力可能受到其空间排列的影响，如特定的糖链结构在唾液酸化后可能表现出更强的结合能力。这些发现不仅有助于我们更深入地理解糖链与蛋白质的相互作用机制，也为糖链微阵列的设计和应用提供了新的方向。

本研究还涉及了多个糖链结构的结合模式分析，如Siglec-2、Siglec-3、Siglec-5、Siglec-7和Siglec-8等。其中，Siglec-2表现出对Neu5Gc的更强结合能力，这与一些先前研究结果有所不同。而Siglec-3的结合能力则受到糖链结构中是否存在岩藻糖的影响，只有在岩藻糖修饰的情况下才表现出显著的结合信号。这些结果提示我们，某些糖链修饰可能在特定的糖链结合过程中起到关键作用。

此外，研究还探讨了某些糖链结构对特定蛋白质的结合能力。例如，HECA-452抗体能够识别含有特定糖链结构的抗原，如sLe^X和sLe^A，但对含有Neu5Gc的糖链无响应。这表明，某些糖链修饰可能对蛋白质的结合能力产生显著影响。同时，研究还发现某些糖链结构的结合能力可能受到其空间排列的影响，如特定的糖链结构在唾液酸化后可能表现出更强的结合能力。

在实验方法上，本研究采用了多种糖基转移酶和硫酸转移酶进行糖链的修饰，并通过NP-HPLC和RP-HPLC进行纯化。随后，利用MALDI-TOF MS和MS/MS进行结构验证，确保糖链的正确性和纯度。为了提高检测的灵敏度，我们还对糖链进行了荧光标记，并在微阵列上进行打印和结合分析。通过这些方法，我们能够获得更精确的结合数据，并揭示一些之前未被注意到的糖链特异性。

研究结果表明，糖链微阵列不仅能够用于识别特定的糖链结构，还能够为糖链与蛋白质的相互作用提供新的见解。例如，某些糖链修饰可能对特定蛋白质的结合能力产生显著影响，而某些蛋白质可能表现出对特定糖链结构的偏好。这些发现不仅有助于我们更深入地理解糖链的功能，还可能在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。

总的来说，本研究通过构建一个包含多种天然阴离子糖链的微阵列，揭示了糖链与蛋白质相互作用的复杂性。我们发现，某些糖链修饰可能对蛋白质的结合能力产生显著影响，而某些蛋白质则表现出更狭窄的识别特异性。这些发现不仅为糖生物学研究提供了新的工具，也为糖链的快速筛查和诊断应用奠定了基础。通过进一步的研究，我们可以期待这一微阵列在更多生物医学领域中得到应用，为糖链功能的深入理解提供支持。