NLRP3炎症小体基因敲除可抑制年龄相关及R345W Efemp1诱导的基底膜沉积形成

《Cell Death & Disease》：Genetic removal of Nlrp3 protects against age-related and R345W Efemp1-induced basal laminar deposit formation

本研究针对年龄相关性黄斑变性(AMD)和Malattia Leventinese/Doyne蜂窝状视网膜营养不良(ML/DHRD)中基底膜沉积(BLamD)形成的机制，通过构建Nlrp3-/-和Casp1-/-的R345W Efemp1基因敲入小鼠模型，发现遗传消除NLRP3炎症小体通路可显著降低BLamD的大小和覆盖率。该研究不仅揭示了NLRP3在遗传性视网膜营养不良中的关键作用，还证实其对自发年龄相关BLamD的抑制作用，为AMD治疗提供了新靶点。

　　

随着全球人口老龄化加剧，年龄相关性黄斑变性(AMD)已成为老年人不可逆盲的主要病因，预计到2040年将影响近3亿55岁以上人群。这种退行性眼病以视网膜色素上皮(RPE)下出现富含脂质和蛋白质的玻璃膜疣(drusen)为特征，但其分子机制尚未完全阐明。特别值得注意的是，一种罕见的常染色体显性遗传性视网膜营养不良——Malattia Leventinese/Doyne蜂窝状视网膜营养不良(ML/DHRD)，因其临床表现与AMD高度相似而成为理想的研究模型。该疾病由EFEMP1基因的p.R345W突变引起，患者视网膜会出现类似AMD的基底膜沉积(BLamD)。

慢性炎症被认为是AMD等神经退行性疾病的关键启动因子，其中NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体因其能响应多种刺激而备受关注。当被激活时，NLRP3炎症小体通过caspase-1(CASP1)促进白细胞介素-1β(IL-1β)等促炎细胞因子的产生，若持续激活将导致组织损伤。虽然此前研究提示NLRP3可能与AMD病理相关，但其在ML/DHRD中的作用尚未明确。

为探究这一问题，研究人员构建了R345W Efemp1基因敲入小鼠模型，并进一步通过基因编辑技术获得了Nlrp3^-/- R345W^+/+和Casp1^-/- R345W^+/+双基因修饰小鼠。研究团队采用光谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)评估视网膜结构完整性，通过透射电子显微镜(TEM)定量分析BLamD形成情况，利用免疫组织化学检测NLRP3表达和神经炎症标志物，并采用实时定量PCR(qPCR)和细胞因子阵列分析分子变化。

视网膜与RPE结构保持完整

研究发现，即使到20月龄，R345W^+/+小鼠与野生型(WT)小鼠在视网膜各层厚度上无显著差异，总视网膜厚度分别为227.68±8.18μm和225.85±5.42μm。通过REShAPE人工智能软件对RPE扁平铺片分析显示，两种基因型小鼠的RPE细胞面积、六边形性和邻细胞数等形态参数也无统计学差异，表明R345W突变并不引起明显的视网膜或RPE结构改变。

BLamD形成的自然史

通过定量纵向TEM分析，研究人员首次系统描绘了BLamD的形成轨迹。WT小鼠在4-16月龄期间仅形成零星小型BLamD，但在20月龄时覆盖度显著增加。而R345W^+/+小鼠在8-12月龄期间BLamD大小呈现"爆发式"增长，到20月龄时覆盖度接近60%，虽与WT无差异，但沉积物面积平均大2.9倍。

慢性炎症状态的确立

分子分析显示，18月龄R345W^+/+小鼠RPE/脉络膜中补体成分3(C3)、Nlrp3、pro-caspase-1和pro-IL-1β转录水平显著上调。免疫组化结果进一步证实，从12月龄开始，R345W^+/+小鼠视网膜中NLRP3免疫反应性明显增强，且随年龄增长差异愈加显著。

神经胶质细胞激活

研究发现R345W^+/+小鼠从8月龄开始出现明显的穆勒细胞胶质增生，表现为波形蛋白(Vim)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色增强。同时，20月龄R345W^+/+小鼠各视网膜层中离子钙结合适配器分子1(Iba1)⁺小胶质细胞数量显著增加，并呈现活化状态的肥大样形态。

NLRP3通路的关键作用

最为重要的是，12月龄Casp1^-/- R345W^+/+和Nlrp3^-/- R345W^+/+小鼠的BLamD大小和覆盖度均显著降低。Nlrp3^-/- R345W^+/+小鼠的平均BLamD面积(2.86μm2)甚至低于WT水平(4.39μm2)，而R345W^+/+小鼠为15.88μm2。

机制深入解析

进一步研究发现，Nlrp3缺失虽然不影响R345W诱导的穆勒细胞胶质增生，但能显著减少Iba1⁺细胞在视网膜下空间的浸润，并降低多种细胞因子/趋化因子水平。细胞因子阵列分析显示，R345W^+/+眼中上调的增殖素(proliferin)、Reg3G和WISP-1等免疫调节因子在Nlrp3^-/- R345W^+/+小鼠中恢复至WT水平。

向散发性AMD的转化价值

尤为重要的是，Nlrp3缺失也能保护WT小鼠免受自发性、年龄相关BLamD的形成。12月龄Nlrp3^-/- WT小鼠的BLamD大小和覆盖度显著低于同龄WT小鼠，表明这一保护作用不仅限于遗传性视网膜营养不良，也可能适用于散发性AMD。

本研究首次明确证实NLRP3炎症小体在ML/DHRD病理中的关键作用，为这一罕见疾病提供了新的治疗靶点。同时，研究结果具有向常见病AMD转化的重要潜力，提示针对NLRP3的抑制剂(如MCC950)可能成为治疗选择。研究还提出了BLamD形成的定量时间窗口，为未来治疗试验提供了最佳干预时机参考。

值得注意的是，虽然Nlrp3缺失能缓解小胶质细胞活化和BLamD形成，但不影响穆勒细胞胶质增生，表明这两种神经炎症反应可能通过不同通路介导。未来研究需要明确参与BLamD形成的细胞类型及其具体机制，以及眼部局部与全身性NLRP3在病理中的相对贡献。

这项发表于《Cell Death and Disease》的研究不仅深化了我们对视网膜退行性疾病机制的理解，也为开发针对NLRP3炎症小体的治疗策略提供了坚实证据，为数百万AMD和ML/DHRD患者带来了新的希望。