铁过载在缺血性中风中调节星形胶质细胞与神经元之间的不同细胞命运及其调控机制

《Advanced Science》：Iron Overload Mediates the Differential Cell Fate of Astrocytes from Neurons and Its Regulatory Mechanisms in Ischemic Stroke

铁沉积和铁蛋白脂质过氧化在缺血性中风后脑部发生，神经元和星形胶质细胞呈现不同命运：多数神经元发生铁介导的脂质过氧化性铁蛋白样细胞死亡（ferroptosis），而星形胶质细胞通过上调Nrf2-GPX4/SCL7A11抗氧化通路抵抗铁蛋白样细胞死亡，并呈现增殖反应形成胶质瘢痕。研究发现铁过载通过增加TfR1膜定位及棕榈酰化促进星形胶质细胞铁摄入，其机制涉及CPT1A代谢紊乱和Fenton反应增强的脂质过氧化。抗氧化剂或铁螯合剂（如Fer-1、DFO）可显著减轻中风损伤，抑制胶质瘢痕形成

　　在缺血性卒中发生时，大脑中会出现铁积累和铁死亡的现象。然而，铁过载与细胞类型特异性命运之间的关系尚不明确。本研究发现，缺血性卒中患者在急性期和亚急性期的病灶周围皮层中，铁沉积和神经元丢失的现象显著。研究指出，缺血/再灌注（I/R）引发的铁过载主要在神经元中诱发铁死亡，而在少突胶质细胞中则相对较少。同时，大多数少突胶质细胞经历反应性增殖。机制上，神经元或少突胶质细胞中Nrf2/GPX4和SLC7A11水平的降低或升高是这些细胞命运差异的主要原因。此外，铁过载通过增强某些增殖相关基因的转录活动，促进了少突胶质细胞的星形胶质增生。

在本研究中，科学家利用了部分敲除转铁蛋白受体1（TfR1）基因Tfrc的小鼠模型，以及少突胶质细胞特异性Tfrc敲除和条件性少突胶质细胞Cpt1a部分敲除（诱导脂肪酸代谢障碍）等实验手段，揭示了TfR1的棕榈酰化和网格蛋白介导的内吞作用驱动了少突胶质细胞中的铁过载。值得注意的是，缺血/再灌注诱导的棕榈酸水平升高与TfR1棕榈酰化增强密切相关。使用抗氧化剂或铁螯合剂能够缓解缺血性脑损伤。这些发现为理解缺血/再灌注引发的铁过载与细胞类型特异性命运之间的关系提供了全面的框架，TfR1的棕榈酰化被证明是缺血性卒中治疗的一个潜在靶点。

缺血性卒中是全球第二大死亡原因，包括缺血性和出血性卒中。尽管在再灌注治疗方面取得了一定进展，例如使用溶栓药物如阿替普酶（tPA）和替奈普酶（TNK-tPA）以及血管内血栓切除术，但目前仍需要探索新的药物靶点和脑保护剂，以在再灌注前或再灌注过程中保护大脑免受损伤，从而延长治疗窗口并改善功能预后。神经元死亡和胶质细胞激活、胶质瘢痕形成是缺血性卒中的两个主要病理组织学特征。在缺血核心区域，细胞迅速死亡，包括神经元和少突胶质细胞，而在病灶周围区域，神经元遭受严重损伤，大部分死亡，而少突胶质细胞则发生反应性增殖，最终形成胶质瘢痕。反应性少突胶质细胞与异常神经元活动和神经元死亡相关，但其在缺血性卒中后是否经历铁死亡仍不明确。

铁死亡是一种依赖铁的程序性细胞死亡，其特点是氧化应激与抗氧化防御失衡以及脂质过氧化物的积累。经典的铁死亡防御系统包括半胱氨酸/谷氨酸反向转运体（System Xc?）-谷胱甘肽（GSH）-谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4），通过减轻脂质过氧化来发挥保护作用。GPX4是细胞中大多数细胞减少脂质过氧化物积累的关键酶。细胞膜上的System Xc?半胱氨酸/谷氨酸反向转运体通过将半胱氨酸交换为谷氨酸，将谷氨酸导入细胞内，其中溶质载体家族7成员11（SLC7A11）是关键的功能亚基。研究表明，缺血性卒中会显著下调神经元中的System Xc?-GSH-GPX4水平，导致神经元发生铁死亡。核因子E2相关因子2（Nrf-2）是一种调控其靶基因表达的转录因子，这些靶基因与内源性抗氧化防御系统有关，包括GPX4和SLC7A11，防止细胞受到过度氧化应激反应和铁死亡的影响。因此，我们提出了一个问题，即神经元和少突胶质细胞在缺血性卒中后的不同命运是否是由于它们对内源性抗氧化防御系统Nrf-2介导的GPX4和SLC7A11基因表达的不同反应所致。

目前，铁过载被认为是导致缺血性卒中发生铁死亡的关键因素。缺血性卒中后，血脑屏障受损，允许大量铁进入脑实质，导致神经元铁过载和铁死亡。铁螯合剂如去铁胺（DFO）可以防止缺血性卒中诱导的铁死亡。铁过载通过芬顿反应直接促进活性氧（ROS）的生成，并且多不饱和脂肪酸（PUFAs）被细胞内ROS氧化，最终导致细胞膜破裂。在中枢神经系统中，少突胶质细胞在调节脑铁稳态方面发挥重要作用，并且其铁含量是神经元的两倍。铁过载在多种神经系统疾病中被发现，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和多发性硬化症（MS）。此外，缺氧预处理会诱导少突胶质细胞摄取细胞外铁，从而导致细胞铁含量逐步增加。然而，铁过载与少突胶质细胞铁死亡和反应性增殖以及胶质瘢痕形成之间的关系仍然不明确。

铁过载源于细胞铁稳态的失衡。细胞内的可溶性铁池受到铁的摄取、输出、储存和利用的调控。细胞铁摄取主要由转铁蛋白/转铁蛋白受体（Tf-TfR）系统调控，该系统在铁死亡中起作用。转铁蛋白受体1（TfR1）广泛表达于人类细胞中，由两个通过二硫键连接的同源二聚体亚基组成。细胞外游离Fe3?与转铁蛋白结合，导致转铁蛋白构象变化，并与TfR1结合于细胞膜上。Fe3?-Tf-TfR1复合物通过网格蛋白介导的内吞作用形成囊泡，Fe3?在细胞内酸性环境中被STEAP3（STEAP家族成员3）还原为Fe2?，然后由二价金属转运蛋白1（DMT1）介导释放到细胞质中的可溶性铁池。同时，Tf-TfR1复合物从高尔基体转移到细胞表面，随后转铁蛋白与TfR1解离，完成Tf-TfR1的回收。在Tf-TfR1回收加速的情况下，大量细胞外铁被转运到细胞质中，导致细胞铁过载。棕榈酰化是一种蛋白质的后翻译修饰，其中16碳的棕榈酸链被连接到蛋白质的半胱氨酸残基上。棕榈酰化在TfR1定位到细胞膜、调控其回收和介导铁摄取中起重要作用。一些研究表明，TfR1棕榈酰化的失调会影响Tf-TfR1循环，导致神经退行性疾病中的细胞铁过载。然而，如何通过TfR1棕榈酰化导致缺血性卒中诱导的反应性少突胶质细胞中的细胞铁过载仍不清楚。

在本研究中，我们发现缺血性卒中诱导的铁过载在神经元中引发铁死亡，而在少突胶质细胞中则相对较少，大多数少突胶质细胞发生反应性增殖。特别地，我们阐明了在缺血性卒中患者病灶周围皮层中，铁沉积和神经元功能损伤/神经元丢失。这些不同细胞命运的机制与铁过载在神经元或少突胶质细胞中诱导的Nrf-2/GPX4和SLC7A11水平的降低或升高有关。通过使用Tfrc部分敲除的小鼠、少突胶质细胞特异性Tfrc敲除或条件性少突胶质细胞Cpt1a部分敲除（诱导脂肪酸代谢障碍），我们揭示了在缺血性卒中后，TfR1棕榈酰化和网格蛋白介导的TfR1内吞作用导致了少突胶质细胞中的铁过载。缺血性卒中诱导的脂肪酸增加，特别是棕榈酸水平升高，与TfR1棕榈酰化增强有关。我们证明抗氧化剂或铁螯合剂能够保护大脑免受缺血性卒中损伤。

我们进一步研究了铁过载如何诱导少突胶质细胞的增殖。我们使用3.13 μM的FAC处理HA细胞，通过RNA测序（RNA-seq）分析观察铁过载对增殖相关基因的影响。我们发现，在少突胶质细胞中，多个增殖相关基因的表达水平随着FAC处理而增加。其中，包括CCN1（细胞通讯网络因子1）、CCNE2（细胞周期蛋白E2）和PLK2（ polo like kinase 2）等基因，其在两组之间的变化最大且组内差异最小。FAC处理后，这些基因的蛋白水平在少突胶质细胞中增加，而对照组则没有显著变化。进一步结果显示，FAC处理后，这些蛋白的水平在少突胶质细胞中显著增加，而DFO处理则显著减少了这些蛋白的水平。这些结果表明，铁过载通过促进多个增殖相关基因的转录活动导致了少突胶质细胞的星形胶质增生。

接下来，我们研究了TfR1的表达和棕榈酰化如何导致缺血性卒中后的铁过载。我们发现，在缺血性卒中的急性期，TfR1的蛋白水平在脑皮层中逐渐增加，从6到24小时后，伴随Fe2?水平的升高。在亚急性期，免疫组织化学结果表明，反应性少突胶质细胞中的TfR1免疫染色在缺血后第3天到第14天逐渐增加，并在第14天达到峰值，伴随大量铁沉积。与体内结果一致，OGD/Re处理的少突胶质细胞中TfR1的蛋白水平增加。为了进一步探讨TfR1在缺血性卒中的作用，我们构建了Tfrc杂合子敲除小鼠，这些小鼠的TfR1表达水平比野生型（WT）小鼠低。这表明Tfrc杂合子敲除小鼠成功建立。我们发现，与WT小鼠相比，Tfrc杂合子敲除小鼠表现出较低的梗死体积、改善的神经功能缺损评分以及缺血后第24小时在病灶周围区域Fe2?水平的降低。它们还表现出脑组织Fe2?水平的下降以及病灶周围区域少突胶质细胞的铁沉积减少，以及胶质瘢痕厚度的降低。此外，我们还建立了少突胶质细胞特异性条件性Tfrc敲除（Tfrc cKD）小鼠，通过静脉注射靶向少突胶质细胞的腺相关病毒（AAV）进行转染（图5d,e）。我们发现，Tfrc cKD小鼠的梗死体积减少，神经功能缺损评分改善，并且在缺血后第24小时病灶周围区域Fe2?水平下降。此外，它还抑制了少突胶质细胞的铁沉积（图5h）和胶质瘢痕厚度（图5i）。这些结果表明，TfR1介导的铁过载在少突胶质细胞中导致了缺血性卒中诱导的脑损伤和胶质瘢痕形成。

TfR1的铁摄取功能受到其棕榈酰化修饰的调控。棕榈酰化在TfR1定位到细胞膜、调控其功能和介导铁摄取中起重要作用。一些研究指出，TfR1棕榈酰化的失调会影响Tf-TfR1循环，导致神经退行性疾病中的细胞铁过载。然而，如何通过TfR1的棕榈酰化导致缺血性卒中诱导的反应性少突胶质细胞中的铁过载仍然不明确。我们使用了基于点击化学反应（CCR）的方法，发现OGD/Re处理的HA细胞中TfR1的总棕榈酰化和细胞膜上的棕榈酰化水平都增加（图6a,b）。2-溴棕榈酸（2-BP）作为通用的蛋白棕榈酰化抑制剂，可以显著降低总TfR1水平（图6b），总TfR1棕榈酰化水平（图6b）以及棕榈酰化TfR1在细胞膜上的定位（图6a），同时降低Fe2?水平（图6c）。此外，2-BP处理可以显著减少反应性少突胶质细胞中的铁沉积（图S7j，补充信息）和病灶周围区域的胶质瘢痕厚度（图S7k，补充信息）。这些结果表明，TfR1的棕榈酰化通过促进网格蛋白介导的TfR1内吞作用和细胞外铁的摄取，导致了少突胶质细胞中的细胞内铁过载。

我们进一步研究了棕榈酸水平的升高如何促进TfR1的棕榈酰化。大量游离脂肪酸在缺血性卒中后会在脑脊液中积累，包括棕榈酸（PA）。PA是人体中最常见的脂肪酸之一，其增加可以作为蛋白质棕榈酰化修饰的修饰物，如TfR1。我们研究了外源性棕榈酸对TfR1棕榈酰化和少突胶质细胞铁过载以及增殖的影响。我们发现，1和5 μM的PA能够显著增加细胞活力，表明棕榈酸可以促进HA细胞的增殖（图7a）。1 μM的PA处理24小时后，可以促进TfR1（图7b）和棕榈酰化TfR1（图7c）的蛋白水平，并增加HA细胞中的细胞内Fe2?水平（图7d）。这些结果表明，PA促进了TfR1的棕榈酰化和少突胶质细胞的铁过载。

脂肪酸在一系列酶促反应中被氧化，并在细胞内产生能量。肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）位于线粒体外膜，将长链脂肪酰辅酶A转化为L-棕榈酰肉碱，这是长链脂肪酸进入线粒体进行β-氧化代谢的关键步骤。我们通过诱导CPT1A功能障碍来建立脂肪酸代谢紊乱的模型，其中在少突胶质细胞中，棕榈酰化修饰的PA应增加。我们首先观察了CPT1A抑制剂Eto对PA水平的影响。气相色谱-质谱（GC-MS）分析显示，在OGD/Re处理或Eto处理后，27种中长链脂肪酸的水平发生变化（图7e；数据S1，补充信息）；PA在OGD/Re处理的HA细胞中增加，而Eto处理进一步增强了这些细胞中的PA水平（图7e,f）。我们进一步研究了Eto诱导的CPT1A功能障碍对TfR1棕榈酰化的影响。CCR分析显示，在OGD/Re处理的HA细胞中，TfR1的总蛋白和细胞膜上的棕榈酰化水平增加，而Eto处理进一步增强了OGD/Re介导的TfR1总蛋白水平、棕榈酰化TfR1水平和其在细胞膜上的定位（图7g；图S10a，补充信息）以及Fe2?水平（图7h）。我们还观察了CPT1A功能障碍对少突胶质细胞铁过载的影响，使用条件性少突胶质细胞Cpt1a杂合子敲除小鼠（Cpt1a As+/?）（图S10b，补充信息）。Western Blotting和免疫组化结果表明，Cpt1a As+/?小鼠的脑皮层少突胶质细胞中CPT1A的表达水平比WT小鼠低（图S10c,d，补充信息）。同样，在OGD/Re处理后，Cpt1a As+/?少突胶质细胞或Eto处理的HA细胞中，TfR1棕榈酰化水平增加（图7i；图S10e，补充信息）以及Fe2?水平（图7j）增加。与体内结果一致，Cpt1a As+/?小鼠在缺血后第14天，其脑皮层中TfR1的表达水平增加，同时铁沉积（图S10h，补充信息）和胶质瘢痕厚度（图S10i，补充信息）也增加。然而，在体内，虽然Cpt1a As+/?小鼠和WT小鼠在缺血后第14天的病灶周围区域Fe2?水平无显著差异（图S10f，补充信息），但Cpt1a As+/?小鼠表现出TfR1染色增加（图S10g，补充信息）和反应性少突胶质细胞中的铁沉积增加（图S10h，补充信息），以及Fe2?水平的增加（图S10i，补充信息）。相比之下，CPT1A过表达的HA细胞表现出细胞膜上的TfR1棕榈酰化水平和网格蛋白介导的TfR1内吞作用的减少，以及Fe2?水平的下降。这些结果表明，CPT1A功能障碍通过提供棕榈酸促进TfR1的棕榈酰化和网格蛋白介导的TfR1内吞作用，加速了铁的摄取，导致铁过载，进而促进少突胶质细胞中GPX4和SLC7A11的高表达、ROS的产生和脂质过氧化，最终诱导了星形胶质增生。

接下来，我们研究了TfR1的棕榈酰化如何影响网格蛋白介导的TfR1内吞作用。免疫荧光结果表明，在OGD/Re处理的HA细胞中，Eto处理可以促进TfR1和网格蛋白的共定位（图S11a，补充信息），而CPT1A过表达则减少了它们的共定位（图S11b，补充信息）。这些结果表明，CPT1A功能障碍促进了TfR1的棕榈酰化和网格蛋白介导的TfR1内吞作用，加速了相对少突胶质细胞的铁过载。此外，我们发现补充铁的FAC处理增加了HA细胞中TfR1和网格蛋白的共定位，表明过量的铁加速了网格蛋白介导的TfR1内吞作用。

棕榈酸是一种饱和脂肪酸，是蛋白质脂化（如棕榈酰化）的重要底物。棕榈酸转化为棕榈酰辅酶A，然后通过可溶性硫酯键结合到蛋白质的半胱氨酸残基上。这一可逆过程被称为S-棕榈酰化。我们假设缺血性卒中诱导的脂肪酸紊乱可以增加棕榈酸水平，从而次级影响TfR1的棕榈酰化。CPT1A是脂肪酸β-氧化的关键限速酶，其中肝脏异构体CPT1A位于线粒体外膜，将酰基辅酶转化为酰基肉碱，然后通过膜进入线粒体进行β-氧化。我们使用了条件性少突胶质细胞Cpt1a杂合子敲除小鼠（Cpt1a As+/?）或CPT1A抑制剂Eto来诱导少突胶质细胞的脂肪酸紊乱。GC-MS方法分析了OGD/Re处理的HA细胞中棕榈酸水平的增加，而Eto处理进一步增强了OGD/Re介导的HA细胞中棕榈酸水平的增加。Cpt1a As+/?小鼠或Cpt1a As+/?少突胶质细胞或Eto处理的HA细胞中，TfR1棕榈酰化水平和其在细胞膜上的定位增加，同时网格蛋白介导的TfR1内吞作用增加，伴随Fe2?、ROS和脂质过氧化水平的增加，以及少突胶质细胞中GPX4和SLC7A11的水平增加。相比之下，CPT1A过表达的HA细胞表现出细胞膜上的TfR1棕榈酰化水平和网格蛋白介导的TfR1内吞作用的减少，以及Fe2?水平的降低。这些结果表明，少突胶质细胞中CPT1A功能障碍通过提供棕榈酸促进了TfR1的棕榈酰化和网格蛋白介导的TfR1内吞作用，加速了铁的摄取，导致铁过载，进而促进了少突胶质细胞中GPX4和SLC7A11的高表达、ROS的产生和脂质过氧化，最终诱导了星形胶质增生。此外，我们的结果显示，补充外源性棕榈酸可增加HA细胞中TfR1的棕榈酰化和细胞内Fe2?水平，并促进HA细胞的增殖。我们不能排除棕榈酸水平的增加可能影响其他细胞途径，如炎症或脂质信号，从而导致少突胶质细胞和星形胶质增生的增加。例如，棕榈酸通过激活Toll样受体（TLR）2和4介导的信号通路，增加促炎细胞因子的产生，并促进ROS的生成。在细胞内，棕榈酸代谢为饱和二酰甘油、神经酰胺和溶血磷脂酰胆碱，这些物质会导致炎症反应。棕榈酸作为中长链饱和脂肪酸，是脂质代谢的重要组成部分。过量的棕榈酸可以破坏脂肪酸代谢的平衡，导致各种代谢紊乱，如细胞膜稳定性降低、脂质滴积聚和细胞衰老。所有这些由棕榈酸介导的效果可能也涉及少突胶质细胞和星形胶质增生的增加。

蛋白S-棕榈酰化是由一类称为蛋白酰基转移酶的跨膜蛋白动态调控的，这些蛋白具有锌指和天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸结构域（DHHCs）以及去棕榈酰化酶（APTs，如PPT1/2）。最近的一项研究发现，DHHC5介导的TfR1棕榈酰化在少突胶质细胞中减少与新生儿七氟烷暴露相关的神经毒性有关。未来需要进一步研究DHHC5介导的TfR1棕榈酰化在缺血性卒中诱导的铁过载和脑损伤中的作用。

最后，我们证明了抗氧化剂Fer-1或铁螯合剂DFO或循环中缺铁的使用可以减少脑内铁和促铁死亡因子的水平，并增加抗氧化因子，从而保护神经元和少突胶质细胞并抑制星形胶质增生。有趣的是，Fer-1和DFO可以在OGD/Re处理后增加神经元中GPX4和SLC7A11的表达，但在少突胶质细胞中没有显著效果。铁过载通过芬顿反应在细胞中导致ROS积累。一旦ROS的过量产生超过毒性阈值或抗氧化系统受损，癌细胞会发生死亡；维持ROS水平低于毒性阈值可以促进癌细胞的生存和增殖。在我们的研究中，我们发现，在OGD/Re处理后，神经元中ROS水平的升高和Nrf-2/GPX4、SLC7A11表达的减少导致了铁死亡，而在少突胶质细胞中，ROS水平低于毒性阈值，同时Nrf-2/GPX4和SLC7A11的表达增加，导致了少突胶质细胞的反应性增殖。抗氧化剂和铁螯合剂可以减少缺血性神经元中的ROS水平，并增加GPX4和SLC7A11的水平，从而保护神经元免受铁死亡。尽管Fer-1和DFO对OGD/Re处理的少突胶质细胞中GPX4和SLC7A11的水平没有显著影响，但它们减少了少突胶质细胞中的ROS水平，从而减轻了星形胶质增生。DFO是一种获得FDA批准用于治疗急性铁过载的铁螯合剂，一项针对缺血性卒中患者的II期临床试验（II期，NCT00777140）已经完成。在tPA输注期间，使用安慰剂或单次DFO静脉注射后，再连续输注三种逐渐增加剂量的DFO，显示出DFO在中重度缺血性卒中（NIHSS > 7）患者中可以挽救神经功能缺损，且未发现溶栓并发症。然而，DFO在血清/血浆中的半衰期较短（5–17分钟），这限制了其临床应用，因此改进其结构或将其转化为缓释制剂可能增加其半衰期并减少副作用，从而促进其在缺血性卒中治疗中的临床转化。一些新型的铁螯合剂正在临床前研究中，例如BHAPI是一种铁螯合剂，仅在氧化应激条件下表现出强的游离铁结合能力，并能恢复线粒体能量利用，提高OGD处理的HT22细胞的细胞活力。衍生物11，一种由deferasirox和celecoxib合成的衍生物，保留了它们的活性基团，可促进PC12细胞的神经保护，并减少大鼠中的梗死体积和神经功能缺损。

本研究揭示了铁过载在神经元和少突胶质细胞中引发相似的氧化应激变化，但其内源性抗氧化防御系统表现出相反的表达模式，这成为铁死亡不同结果的中心机制。我们发现，TfR1的棕榈酰化增加促进了网格蛋白介导的TfR1内吞作用和细胞外铁的摄取，导致了少突胶质细胞中的细胞内铁过载。我们还揭示了缺血/再灌注诱导的脂肪酸积累，特别是棕榈酸是TfR1 S-棕榈酰化的关键调节因子。这些发现将推进对细胞特异性铁死亡模式的新概念，并提供针对降低缺血性卒中诱导的铁过载的有前景的治疗策略，包括使用铁螯合剂或抗氧化剂，抑制TfR1 S-棕榈酰化以及改善脂肪酸积累。