识别与铁死亡（Ferroptosis）相关的关键基因作为缺血性中风的潜在诊断生物标志物：基于综合生物信息学分析和实验的证据

《Cellular and Molecular Neurobiology》：Identification of Key Ferroptosis-Related Genes as Potential Diagnostic Biomarkers for Ischemic Stroke: Evidences from Integrated Bioinformatics Analysis and Experiments

缺血性中风（IS）中 ferroptosis 相关基因的筛选及诊断模型建立。通过整合差异表达分析、WGCNA和PPI网络分析，筛选出15个候选基因，结合机器学习算法（LASSO、随机森林、RGF、LightGBM）确定ATM、DUSP1、SRC和STAT3为关键生物标志物。OGD/R模型验证显示ATM表达降低，DUSP1、SRC和STAT3表达升高。生物标志物与神经炎症通路及免疫细胞浸润（中性粒细胞、巨噬细胞、CD8 T细胞）显著相关，建立的诊断模型AUC>0.8，验证其在训练集、测试集及独立外部数据集中的高预测性能。

　　本文探讨了铁死亡（ferroptosis）相关基因在缺血性中风（ischemic stroke, IS）中的作用及其与免疫炎症反应之间的关系。铁死亡是一种依赖铁离子的程序性细胞死亡方式，其特征在于脂质过氧化的积累。近年来，铁死亡与缺血性中风的发生和发展密切相关，因此，研究铁死亡相关基因在中风中的作用具有重要意义。该研究通过整合差异分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析，筛选出关键的铁死亡相关基因，并利用多种机器学习算法识别潜在的诊断生物标志物，最终构建了一个具有较强预测能力的诊断模型。此外，研究还评估了这些生物标志物与神经炎症途径及免疫细胞浸润之间的关联，为中风的早期诊断和治疗提供了新的思路。

### 铁死亡与缺血性中风的联系

铁死亡在多种神经系统疾病中被发现与病理过程相关，特别是在缺血性中风中。中风通常是由大脑动脉阻塞导致的血流不足，从而引发一系列病理生理变化，包括免疫细胞的浸润和神经元死亡。研究表明，铁过载不仅会通过生成活性氧（ROS）诱导氧化损伤和细胞死亡，还会通过催化羟基自由基的形成，导致脂质过氧化和铁死亡。这种细胞死亡机制与中风的病理特征密切相关，因此，铁死亡相关基因可能成为中风诊断和治疗的新靶点。

### 筛选关键铁死亡相关基因

为了确定与中风相关的铁死亡相关基因，研究者首先整合了三种基因集合：差异表达基因（DEGs）、铁死亡相关基因（FRGs）和WGCNA识别的中风相关基因模块。通过Venn分析，筛选出102个同时存在于这三个集合中的基因。随后，利用PPI网络分析，识别出一个由15个基因组成的显著子网络，这些基因显示出密切的相互作用，表明它们可能共同参与中风的病理过程。进一步的分析表明，这些基因在中风组织中发生了显著的表达变化，可能在铁死亡调控中发挥关键作用。

### 机器学习算法识别诊断生物标志物

研究采用四种机器学习算法，包括LASSO回归、随机森林（Random Forest）、正则化贪婪森林（RGF）和LightGBM，对上述15个候选基因进行筛选，以识别具有诊断潜力的生物标志物。LASSO回归、随机森林和RGF算法均筛选出包含ATM、DUSP1、SRC和STAT3在内的四个基因，而LightGBM算法也识别出这四个基因。最终，通过这些算法的交叉分析，确定了这四个基因作为共同的诊断标志物。基于这四个基因构建的诊断模型在训练集和验证集中均表现出良好的预测能力，其AUC值均超过0.8，表明其在中风诊断中具有较高的准确性和可靠性。

### 诊断生物标志物与神经炎症及免疫细胞浸润的关系

研究进一步分析了这四个基因与神经炎症途径及免疫细胞浸润之间的关系。通过基因集变异分析（GSVA）发现，中风样本中WP神经炎症途径的激活程度显著高于对照组。同时，通过CIBERSORT算法对免疫细胞浸润情况进行了评估，结果显示中风样本中中性粒细胞、巨噬细胞和激活记忆CD4 T细胞的丰度显著增加，而记忆B细胞、CD8 T细胞和静息记忆CD4 T细胞的丰度则显著减少。这些结果表明，中风引发的免疫反应在疾病进展中起到了重要作用，而ATM、DUSP1、SRC和STAT3的表达变化与这些免疫细胞的丰度变化密切相关。

### 体外实验验证生物标志物的表达

为了进一步验证这四个基因在中风中的表达变化，研究者在HT-22细胞中建立了氧-葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）诱导的神经元损伤模型。实验结果显示，在OGD/R刺激下，ATM的mRNA和蛋白水平显著降低，而DUSP1、SRC和STAT3的表达水平则显著升高。这一结果与生物信息学分析结果一致，表明这些基因在中风模型中具有显著的表达变化，可能在中风的病理机制中发挥重要作用。

### 诊断模型的构建与评估

基于这四个基因构建的诊断模型在训练集和验证集中均表现出较高的AUC值，分别为0.902和0.856，而在独立的外部数据集GSE22255中，模型的AUC值为0.820，进一步验证了其诊断价值。此外，研究还通过ROC曲线评估了该模型在不同数据集中的预测性能，结果表明该模型在不同数据集中均具有良好的稳定性。这表明ATM、DUSP1、SRC和STAT3可能作为中风的潜在生物标志物，具有实际应用价值。

### 未来研究方向

尽管本研究取得了重要进展，但仍然存在一些局限性。例如，体外实验的样本量未经过预计算，而是基于以往经验确定，这可能影响结果的可靠性。此外，用于Western blot的抗体特异性未进行评估，这也是研究的不足之处。未来，需要在更大的临床样本中验证这四个基因的表达变化，并通过功能实验进一步探究其在中风发生和发展中的具体作用机制。特别是需要明确这些基因在神经元损伤和修复过程中的角色，以期为中风的治疗提供新的思路和靶点。

### 结论

综上所述，本研究通过整合多种生物信息学方法和机器学习算法，识别出了ATM、DUSP1、SRC和STAT3作为缺血性中风的潜在诊断生物标志物。这些基因不仅在中风中表现出显著的表达变化，还与神经炎症途径及免疫细胞浸润密切相关。研究结果表明，铁死亡与中风的发生和发展存在紧密联系，这四个基因可能成为中风诊断和治疗的新靶点。未来的研究需要进一步探讨这些基因在中风中的具体作用机制，并在临床样本中验证其诊断价值，以期为中风的精准诊断和治疗提供科学依据。