综述：在理解进化过程中的人类骨骼方面，新的方法论方法和见解不断涌现

《Current Opinion in Genetics & Development》：New methodological approaches and insights gained toward understanding the evolved human skeleton

本文综述了现代人类骨骼肌系统的适应性进化，通过单细胞测序、空间转录组学等技术，揭示了调控骨骼发育的非编码遗传元件及比较基因组学方法的应用，并探讨了这些发现对疾病风险研究的启示。

　　人类在骨骼结构上与非洲大猿，如黑猩猩、倭黑猩猩和大猩猩存在显著差异。这些差异反映了人类进化过程中脊柱、骨盆、膝盖和脚部形态向直立行走的适应性转变，肩部、肘部和手部的形态则适应了投掷和精确物体操作的需求，而大脑体积的扩大和头面部形态的变化则与复杂文化及语言认知能力的提升有关。然而，这些适应性特征的分子基础仍不清楚，主要由于在连接DNA碱基对与表型之间存在实验上的困难。本文将探讨近年来生命科学领域在连接基因型与表型方面取得的方法学进展，并讨论这些进展如何为理解人类骨骼进化的分子机制铺平道路。此外，我们还将探讨这些适应性变化在现代疾病风险中的重要性。

在人类进化过程中，骨骼系统的发育和形态变化是至关重要的。脊柱的直立形态、骨盆的结构优化、膝盖和足部的适应性进化，都是直立行走的关键特征。这些变化不仅影响了人类的运动方式，也对我们的生存环境和生活方式产生了深远影响。与此同时，肩部、肘部和手部的形态变化使得人类能够进行更精确的物体操作和投掷，这在狩猎和工具使用中具有显著优势。此外，大脑体积的扩大和头面部形态的改变，使得人类能够发展出复杂的语言系统和文化行为，从而在进化过程中脱颖而出。这些变化的分子机制，是理解人类独特性的重要基础。

然而，这些骨骼特征的形成与演化，长期以来在分子层面的研究中被忽视。主要原因在于骨骼组织的密度和矿化特性，使得其难以在不破坏细胞结构的情况下进行分子分析。因此，骨骼组织长期被排除在主要的基因组学研究项目之外，如DNA元件百科全书（Encyclopedia of DNA Elements, ENCODE）、Roadmap表观基因组计划和dGTEx数据库。尽管如此，骨骼相关疾病却影响了全球近一半的人口，这使得研究骨骼发育的分子机制变得尤为重要。近年来，随着高通量单细胞（sc）和单核（sn）RNA测序、sc多组学分析、高分辨率空间转录组学、CRISPR基因编辑筛查、功能性筛选和细胞培养技术的发展，我们开始能够更系统地揭示骨骼发育过程中调控序列与基因之间的联系。

这些技术的突破，使得骨骼生物学从一个样本稀少的研究领域转变为一个动态的、以细胞为单位的图谱。研究人员现在可以详细记录之前难以获取的人类骨骼发育阶段，从而更深入地理解骨骼发育的分子机制。例如，Zhang等人通过分析人类后肢的12万多个细胞，结合空间转录组学技术，揭示了四肢发育的时间线，并识别了与先天性肢体畸形相关的基因。这些研究不仅提供了骨骼发育的详细信息，还展示了单细胞和空间多组学技术在骨骼生物学研究中的巨大潜力。

与此同时，比较灵长类动物的基因序列分析也为理解人类骨骼特征的分子基础提供了重要线索。人类加速区域（Human Accelerated Regions, HARs）是一类在人类中快速进化的保守序列，通常作为发育调控元件起作用。这些区域在肢体和骨盆发育过程中尤为活跃，并且对神经发育也具有重要影响。HARs不仅在人类基因组中富集，而且在其他灵长类动物中也有类似的加速区域，如黑猩猩加速区域。这些区域的比较分析，揭示了人类骨骼特征与非人类灵长类动物之间的差异，为理解人类骨骼进化的分子机制提供了重要方向。

除了HARs，还有其他类型的基因序列变化，如人类祖先快速进化区域（Human Ancestor Quickly Evolved Regions, HAQERs）和人类特异性缺失区域（Human-Specific Conserved Element Deletions, hCONDELs）。这些区域的变异可能影响骨骼发育过程中的基因表达，从而导致特定的骨骼特征。例如，hCONDELs的缺失可能改变增强子的活性，进而影响骨骼发育。这些研究强调了非编码基因组在骨骼发育中的重要性，并为理解人类骨骼进化的分子基础提供了新的视角。

此外，单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs）在人类骨骼发育和疾病风险中的作用也得到了越来越多的关注。许多SNPs在不同人群中表现出高度多态性，这些变异可能通过基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）揭示其与骨骼特征和疾病风险之间的关联。例如，一项关于身高的人群GWAS研究，分析了超过540万人的数据，发现了超过12,000个独立的SNP，这些SNP共同解释了欧洲人群中约40%的身高变异。这一发现不仅揭示了骨骼发育的多基因基础，也为理解骨骼发育的基因调控网络提供了重要依据。

近年来，古代DNA（Ancient DNA, aDNA）研究也取得了显著进展。aDNA是从考古或历史人类遗骸中提取的内源性遗传物质，通常来自骨骼组织。随着下一代测序技术的发展，aDNA研究已经成为理解人类表型进化的重要工具。目前已有数万个古代基因组被测序，这些数据不仅有助于重建人类群体的历史，还能够揭示骨骼发育和形态变化的进化过程。例如，对欧洲古代DNA的研究显示，某些基因在代谢、免疫和色素沉着方面经历了选择压力，这与现代欧洲人群的遗传和表型特征密切相关。这些研究还表明，农业等文化变革可能引发了特定的遗传适应，进而影响了现代人群的健康和生理特征。

与此同时，aDNA研究还揭示了古人类与现代人类之间的基因交流。例如，一些研究发现，尼安德特人和丹尼索瓦人的基因组片段可能已经整合到现代人类的基因组中，这些整合可能影响了现代人类的骨骼形态。例如，一项关于牙齿形态的研究发现，某些基因如PITX2和HS3ST3A1的活动可能与尼安德特人基因组的整合有关，从而影响了现代人类的牙齿大小。这些发现不仅揭示了古人类基因组对现代人类表型的影响，也为理解人类骨骼进化的分子机制提供了新的思路。

在理解骨骼发育的分子机制方面，细胞培养模型也发挥了重要作用。例如，Housman等人利用人和黑猩猩的诱导多能干细胞（iPSCs）构建了一个比较灵长类动物的骨骼细胞培养模型。这些iPSCs被分化为间充质干细胞，并进一步培养为成骨细胞，从而允许研究人员在可控条件下比较不同物种的基因表达。他们发现，人类细胞在成骨分化过程中比黑猩猩细胞更快地进入晚期成骨状态，并且差异表达的基因主要与骨骼发育和细胞外基质相关。这一研究不仅揭示了骨骼发育的调控机制，还为理解人类骨骼特征的分子基础提供了重要线索。

此外，人类和黑猩猩的异源四倍体（allotetraploid）和同源四倍体（autotetraploid）细胞模型也正在被广泛使用。这些模型通过将不同物种的iPSCs融合，生成包含两个物种基因组的细胞，从而允许研究人员区分基因表达中的cis调控和trans调控效应。例如，Gokhman等人利用这一模型研究了cis调控变化对基因表达差异的影响，并发现这些变化可能与人类独特的面部和发声器官形态有关。Song等人则进一步利用这一系统生成了物种特异性的CRISPR-Cas9敲除细胞系，为功能性基因研究提供了新的平台。

随着这些细胞模型的发展，研究人员开始构建骨骼类器官和更复杂的“assembloids”（组合器官）。例如，一项研究将人源诱导多能干细胞（hPSCs）分化为不同区域的软骨模型，并将其组合成一个三维结构。当这些结构在体外培养后，它们能够模拟胚胎肢骨的发育过程，甚至表现出纵向生长的特性。这种模块化设计为研究骨骼发育提供了新的工具，并且可以用来探讨不同物种基因组对骨骼形态的影响。

为了进一步推动骨骼发育研究，一些新的技术平台正在被开发。例如，CellBouncer工具包允许研究人员将多个个体的细胞合并，从而降低大规模单细胞数据分析的成本。这一工具的引入，为未来的人类与灵长类动物“进化发育”（evo-devo）研究提供了重要的技术支持。此外，正在推进的发育基因型-组织表达（dGTEx）项目，旨在建立一个涵盖人类和非人类灵长类动物（如猕猴和狨猴）在不同发育阶段的基因表达、调控和遗传数据的综合资源。这一项目将为科学家提供一个强大的平台，用于比较不同物种的发育基因调控，从而揭示骨骼发育的分子机制。

在骨骼形态研究方面，高分辨率微计算机断层扫描（microCT）技术的应用，使得研究人员能够在不破坏标本的情况下，对骨骼、软骨和软组织进行可视化分析。例如，美国国家科学基金会（NSF）资助的开放灵长类动物（openVertebrate）项目，通过MicroCT扫描和MorphoSource图像数据库，收集了大量博物馆标本的三维数据。这些数据不仅为骨骼形态的比较研究提供了重要支持，也为研究骨骼发育的进化过程提供了基础。然而，目前的数据库主要针对现存物种，而对化石或亚化石标本的数据库仍较为缺乏。建立一个涵盖化石标本的高质量微CT数据库，将有助于更全面地研究人类和灵长类动物骨骼的进化过程，并能够将现代基因研究与可观察的形态变化直接联系起来。

此外，对灵长类动物胚胎材料的系统性研究也显得尤为重要。胚胎标本能够提供骨骼发育的动态过程，而不仅仅是成年形态的静态分析。目前，全球各地的博物馆收藏了大量未被充分研究的灵长类动物胚胎标本，这些标本通常保存在玻璃瓶中或作为组织切片存在。由于伦理限制，研究人员无法直接获取活体灵长类动物的胚胎材料，因此博物馆的收藏成为研究的重要资源。通过非破坏性成像技术，如微CT扫描和对比染色方法，研究人员可以更安全地分析这些标本，并将其与现代基因研究相结合，从而揭示骨骼发育的分子机制。

近年来，Senevirathne等人通过结合博物馆标本、CT扫描、组织学和单细胞技术，揭示了人类骨盆发育的特殊性。他们发现，人类的骨盆在发育过程中经历了两个独特的阶段：首先，骨盆的软骨生长板相对于非人类灵长类动物和小鼠骨盆呈现出约90度的重新定向；其次，骨盆的骨化过程从后部开始，而不是中间部位，且矿化过程在胚胎发育的后期才开始。这些发现表明，人类骨盆的发育模式在基因调控和时间安排上与非人类灵长类动物存在显著差异，这可能与人类直立行走的适应性进化有关。

随着这些技术的不断进步，我们对骨骼发育的分子机制有了更深入的理解。然而，这些研究仍然面临一些挑战。例如，如何将不同细胞类型的基因表达变化与骨骼形态的变化联系起来，如何区分基因表达中的cis调控和trans调控效应，以及如何评估特定基因调控序列在骨骼发育中的作用强度。此外，如何将现代基因研究与化石标本的形态变化相结合，仍然是一个重要的研究方向。未来，通过整合基因组学、表观遗传学、细胞培养、类器官构建和高分辨率成像技术，我们有望更全面地理解人类骨骼的进化过程，并揭示其与现代疾病风险之间的潜在联系。

总的来说，近年来在骨骼发育和进化研究中取得的进展，为我们提供了一个全新的视角。这些方法学突破不仅有助于揭示人类骨骼特征的分子基础，也为理解骨骼相关疾病的遗传机制提供了重要线索。随着技术的不断发展，我们有望在未来的研究中，将基因组学、表观遗传学、细胞培养和高分辨率成像技术更紧密地结合起来，从而更全面地解析骨骼发育的复杂网络。这将不仅有助于揭示人类骨骼的进化轨迹，还将为未来的医学研究和进化生物学研究提供重要的理论基础。