脑内皮细胞-星形胶质细胞终足通讯的分子图谱：揭示外周炎症触发脑屏障信号传导的新机制

《Nature Communications》：Molecular profiling of brain endothelial cell to astrocyte endfoot communication in mouse and human

本研究针对血脑屏障(BBB)中脑内皮细胞(BECs)与星形胶质细胞终足间通讯机制不清的问题，通过开发TurboID介导的终足蛋白质组学方法，结合BEC特异性RNA-seq，首次系统鉴定了小鼠体内BEC-终足配体-受体对，发现外周LPS炎症可动态调控80%以上保守于人类BBB的通讯通路，其中WNT10B-FZD7信号轴被验证为炎症条件下BEC向终足传递外周信号的关键途径，为理解感染相关性认知障碍提供了新视角。

　　

大脑作为人体的“总司令部”，其功能实现离不开与全身各器官的精密协作。然而，机体如何与大脑沟通以协调彼此功能，至今仍是神经科学领域一个认识 remarkably limited（显著有限）的谜题。在这一过程中，血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）扮演着至关重要的“守门人”角色。它严格调控着血液与脑实质之间的物质交换，维持着脑内环境的稳定。在毛细血管层面，BBB是一个由脑内皮细胞（Brain Endothelial Cells, BECs）、周细胞、星形胶质细胞及其基底膜共同构成的多细胞功能实体。

星形胶质细胞通过其特殊的亚细胞结构——终足（endfeet），包裹了大脑约90%的血管表面。这些终足就像是安插在血管壁上的“哨所”，执行着诸多对大脑至关重要的功能：它们从血液中摄取营养物质和激素，加工后分配给其他脑实质细胞；它们调节局部血流；它们促进脑内代谢产物的清除；并且它们还参与维持BBB的健康状态。在毛细血管中，BECs的腔外面同时面向终足和周细胞，其中大部分周长（约63%）与终足相邻，仅由基底膜隔开。事实上，已有研究表明从终足到BECs的信号传导对于终足执行多项功能至关重要。然而，与周围-大脑通讯可能同样关键且密切相关的BEC向星形胶质细胞的信号传递，尽管存在一些体外证据和近期出现的支持其也可能在体内发生的数据，但仍然知之甚少。BEC向星形胶质细胞的信号传递在周围感染的背景下尤其令人关注，因为周围感染是中风、谵妄和痴呆的已知风险因素，但其导致认知衰退的潜在机制尚不清楚。

发表在《Nature Communications》上的这项研究，旨在揭示BBB处BECs与星形胶质细胞终足之间的直接通讯通路，以探究周围-大脑通讯的机制。研究人员开发了一种结合蛋白质TurboID介导的生物素化与血管纯化的方法，首次在小鼠体内定义了星形胶质细胞终足的蛋白质组。结合BEC特异性的翻译组（translatome）数据，他们识别出超过300个可能参与BECs向星形胶质细胞信号传递的配体-受体对，并发现这些相互作用受到周围事件（如脂多糖LPS诱导的外周炎症）的调控。更重要的是，超过80%的小鼠BEC-终足配体-受体对在人类BBB中也存在，其中一部分在人多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）或阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease, AD）患者中与健康个体相比表达差异。这项研究揭示了与人类生理相关的动态BEC-终足通讯通路，并为健康和疾病状态下BEC-星形胶质细胞交互作用的转化研究提供了方法学和数据集。

为开展研究，作者团队运用了几个关键的技术方法：首先，他们利用腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）在小鼠脑中星形胶质细胞特异性表达TurboID（Astrocyte-TurboID）或对照tdTomato（Astrocyte-tdTomato），结合体内生物素注射，实现星形胶质细胞及其终足蛋白质的邻近标记。其次，他们通过大脑微血管分离技术，从注射了Astrocyte-TurboID的小鼠皮质中纯化保留有终足的血管，进而通过链霉亲和素下拉和液相色谱-串联质谱（Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry, LC-MS/MS）鉴定终足蛋白质组。第三，他们利用Cdh5-Cre/ERT2::Ribotag小鼠模型，在LPS或PBS处理后，进行BEC特异性的RNA测序（RNA-seq），分析BEC的基因表达变化。此外，研究还涉及免疫荧光、原位杂交（RNAscope）、组织透明化（CUBIC-X）等用于蛋白定位和表达的验证，并对来自爱丁堡脑组织库的健康成年人（34-45岁）死后额叶皮质样本进行血管分离和蛋白质组学分析，以验证小鼠发现的人类保守性。

结果

Astrocyte-TurboID标记和纯化星形胶质细胞及终足蛋白质

为了识别可能与BECs通讯的终足受体，研究人员首先致力于稳健地定义这一亚细胞区的蛋白质组。他们结合星形胶质细胞特异性的邻近生物素化（由TurboID介导）与血管纯化和LC-MS/MS，克服了以往研究的局限性。通过AAV在小鼠脑中广泛表达胞浆TurboID或对照tdTomato，他们证实了生物素化在终足的高度特异性。基于终足在从脑实质分离的血管上仍保持附着这一发现，他们分离皮质血管并确认其保留了终足且污染极少。血管制备物包含不同大小的血管，其中毛细血管富集度最高（占图像中总血管面积的69%）。在不同类型血管中，终足（通过AQP4信号测量）的覆盖度不同，毛细血管上的终足覆盖度最高。估算显示，纯化血管中83%的终足内容物属于毛细血管，即终足和BECs可以直接相互通讯的血管区段。随后，他们从注射了Astrocyte-TurboID或Astrocyte-tdTomato的小鼠皮质中纯化血管，通过链霉亲和素介导的下拉和LC-MS/MS鉴定纯化蛋白质，分别定义了星形胶质细胞蛋白质组（393个TurboID特有蛋白加上1658个TurboID富集蛋白）和终足蛋白质组（共2293个蛋白）。通过评估已知细胞标记在其数据集中的富集情况，以及分析终足富集蛋白Dp71异构体的肽段数据，进一步证实了终足蛋白质组的特异性。与以往数据集比较显示，他们的方法提供了迄今为止最精确的终足蛋白质组。

终足蛋白质组揭示参与分子运输、代谢和细胞间通讯的蛋白质

为了扩展对终足生物学功能的理解，研究人员使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 进行分析，发现终足蛋白质组显著代表了316条通路。这些通路的分类突出了终足在从血液摄取分子进入大脑（“运输”）以及代谢这些分子（“代谢”、“生物合成过程”）方面的作用。 accordingly，他们在终足蛋白质组中识别出128个溶质转运蛋白，许多参与营养物质摄取。终足最典型的代谢功能之一是糖原的储存和动员以支持神经元功能，他们的终足蛋白质组中包含糖原生成和糖原分解所需的酶。免疫荧光定量证实了PYGB在小鼠和人类皮质终足中的表达。终足蛋白质组中识别的许多通路与免疫和炎症、激素信号或血管功能相关，表明终足包含能够检测和响应外部信号的蛋白质。他们进一步使用CellTalkDB数据库识别出59个具有已知配体和下游信号级联的受体，强调了终足接收趋化因子、细胞因子、生长因子、脂蛋白等信号的能力。

BEC分泌蛋白的表达在外周诱导的炎症后发生改变

终足中炎症相关信号的识别，以及体外数据显示暴露于细菌内毒素LPS的培养BECs的条件培养基可诱导星形胶质细胞反应性表型，促使研究人员假设BECs感知循环信号并在炎症期间向终足释放信号。他们使用小鼠腹腔注射LPS诱导外周炎症的模型，首先通过体内BEC特异性RNA-seq定义了皮质BECs的反应。在确认测序的转录本是BEC特异性后，他们比较了LPS与PBS处理后BEC的基因表达，发现了1017个差异表达基因，包括细胞因子、趋化因子、生长因子和细胞外基质成分编码基因的上调和下调，表明急性炎症反应中稳态基因的下调。这些结果表明BEC基因表达受LPS改变。

BECs和终足之间的通讯通路受LPS调控

研究人员接下来询问终足蛋白质组是否受外周诱导炎症的影响。他们鉴定了LPS与PBS小鼠之间56个独特或差异表达的终足蛋白。对这些蛋白质按其主要功能和通路进行分类表明，LPS通过调节蛋白质降解、翻译或转录来激活终足蛋白质组重塑。其他分子修饰包括细胞骨架重塑、分子运输和细胞粘附。此外，预测有几条细胞间通讯通路在LPS作用下被激活。这些数据表明，在LPS注射后24小时，终足经历了影响细胞内功能及其与周围细胞相互作用的蛋白质组重塑。

为了识别BEC-终足通讯通路并评估这种通讯是否受LPS调控，他们结合LPS和PBS终足蛋白质组，使用CellTalkDB数据库识别BECs中哪些配体在终足中有相应的受体表达。首先，他们在PBS条件下识别出360个BEC-终足配体-受体对，表明BECs和终足之间存在广泛的通讯能力。比较LPS和PBS条件显示，这种关系是动态的，有33对在LPS后下调，53对上调，包括11对在PBS注射小鼠中未发现的“诱导”配对。出乎意料的是，只有少数受LPS改变的配体-受体对是传统的免疫反应相关通路。此外，几个已识别的配体-受体对介导了在LPS注射小鼠终足中识别为改变的通路，表明BEC-终足通讯可能对终足产生下游效应。这些结果证明BECs有能力以情境依赖的方式向终足发出信号，将外周信息传递到脑实质。

WNT10B-FZD7作为BEC-终足通讯的通路

一个由LPS诱导的引人关注的配体-受体对是WNT10B-卷曲蛋白7（Frizzled7, FZD7）。WNT信号已被证明对血管生成、血管发育和BBB维持特别重要。研究人员通过免疫组织化学在表达GFP的星形胶质细胞终足中验证了FZD7的表达，并确认其在血管细胞中的稀缺性。在分离的血管中，信号共定位分析证实FZD7与终足标记物AQP4重合，而与lectin不重合。酶法去除终足导致AQP4和FZD7信号丢失，而lectin信号保留，进一步证明FZD7定位于终足。与蛋白质组学数据一致，LPS后终足区域内FZD7的蛋白定量分析显示其表达与PBS对照无差异。他们接下来通过RNA原位杂交和免疫组织化学评估了WNT10B的表达，证实Wnt10b RNA存在于皮质毛细血管BECs中，其蛋白存在于毛细血管中。RNA和蛋白定量均显示LPS样本血管中WNT10B增加。在人类血管中，FZD7和WNT10B均在毛细血管中显示富集，但与人脑不同，小鼠脑中FZD7表达于血管细胞和终足。他们进一步探索数据集以确定WNT10B-FZD7上游和下游通路是否分别在BECs和终足中检测到，以及它们是否被LPS给药激活。结果表明，LPS可能通过TLR4通路直接激活BECs，诱导NF-κB活性，进而促进Wnt10b的表达。此外，终足拥有局部响应WNT配体的机制，FZD7典型通路下游的大部分蛋白质存在于终足蛋白质组中。利用同一LPS模型中已发表的星形胶质细胞特异性RNA-seq数据，他们证实了核β-连环蛋白（catenin beta-1）的两个基因靶点在RNA水平上調。这些发现表明WNT10B-FZD7信号可能是BECs将外周事件转化为大脑的一种方式，通过检测血液中的信号并直接与终足通讯来调节星形胶质细胞功能。

BEC-终足配体-受体对在人类脑血管中被观察到并在慢性神经系统疾病中发生改变

免疫荧光分析在人类血管中识别出WNT10B-FZD7对。为了进一步研究小鼠和人类之间其他BEC-终足通讯通路的保守程度，研究人员从成年人死后额叶皮质样本中分离脑血管，并使用LC-MS/MS鉴定其蛋白质组。比较配对血管和整体皮质样本中已知脑血管和实质成分的蛋白质丰度，证明了其血管制备物的纯度。与小鼠组织类似，他们确认终足（AQP4免疫阳性）仍附着在纯化的血管上。这些数据表明他们的人类血管制备物纯度高，并保留了BECs和终足，因此可以可靠地用于搜索BEC-终足配体-受体对。他们在人类血管蛋白质组中查询在小鼠中观察到的59个终足受体，发现其中44个（75%）。此外，在对照小鼠中发现的360个BEC-终足配体-受体对中的194对（54%），以及LPS后差异表达的86对中的41对（48%），在小鼠和人类之间是保守的。

为了进一步探索这些配体-受体对与人类生理和病理的相关性，他们接下来检查了它们在已发表的人皮质单核RNA测序（snRNA-seq）和脑血管蛋白质组数据集中的表达，这些数据集比较了多发性硬化症（MS）或阿尔茨海默病（AD）样本与各自年龄匹配的对照。snRNA-seq数据允许他们以细胞分辨率研究这些配体-受体对的表达：配体在血管/内皮细胞簇中，相应的受体在星形胶质细胞簇中。此外，通过纳入来自人类AD和对照脑的血管蛋白质组数据，他们可以在蛋白质水平研究配对表达的改变。他们首先独立于疾病相关变化，在这些数据集中寻找小鼠中识别的配体-受体对。在小鼠中识别的371对中，有309对（83%）也在一个或多个人类数据集中发现。共有34对配体-受体对在所有数据集中共享，还有16对在所有数据集中共享，除了他们的人类蛋白质组。在所有小鼠和人类共享的配体-受体对中，有55对在人类疾病中差异表达。与MS的重叠最大，在AD中显著改变的配对较少。只有18对这些配对在小鼠中也受LPS改变，其中13对在人类疾病中改变方向相同，表明小鼠中识别的许多对急性炎症的BBB反应与人类慢性疾病不同。在人类疾病中差异表达的配对中，ITGAV受体在MS中似乎扮演重要角色。此外，信号素（semaphorin）-NRP2信号脱颖而出，成为进一步研究的有力候选者。NRP2在MS和AD中均差异表达，但方向相反。这些数据表明，小鼠BBB的BEC-终足通讯通路在很大程度上在人类大脑中保守，并通过识别人类血管中与健康和疾病相关的配体-受体对，突出了其转化应用潜力。

结论与意义

本研究为了解周围-大脑通讯的机制，聚焦于BBB，旨在识别BECs与星形胶质细胞终足之间的直接通讯通路。研究人员开发了一种标记和纯化体内小鼠终足蛋白质的方法，克服了以往尝试的局限性，鉴定了更多的终足蛋白质，从而进一步理解了这一亚细胞区室在小鼠和人类大脑生理学中的作用。将该方法与BEC RNA-seq相结合，在有或无腹膜注射LPS的情况下，他们识别出数百条BEC到终足的信号通路。 among those altered after LPS injection, they characterized the WNT10B-FZD7 pair as an illustrative example of how signals from the blood can be translated to the brain via a BEC-endfoot communication axis. Finally, they investigated the conservation of these pathways between mouse and human and identified many ligand-receptor pairs that were shared between the two with some that were affected in human neurodegenerative diseases. Overall, their study defines the molecular underpinnings of in vivo BEC to endfoot communication via a wide variety of signaling pathways, demonstrates that BEC-endfoot interactions are adaptable to events that occur in the periphery, and suggests these interactions are conserved between mouse and human.

该研究为未来令人兴奋的研究铺平了道路，以理解BEC-终足相互作用对大脑健康和疾病的贡献，并凸显了BECs在与神经细胞协调的大脑炎症反应中的作用。急性外周感染是神经退行性疾病的风险因素，并对认知有严重影响，但感染与认知功能障碍之间的机制关系尚不清楚。在人类慢性神经退行性疾病中观察到BEC-终足通讯通路表达改变，突出了评估这些改变的驱动因素及其对导致认知衰退状况的贡献的紧迫性。

研究也存在一些需要考虑的局限性，例如终足蛋白质组中可能存在极少量的少突胶质细胞蛋白污染；蛋白质鉴定过滤参数的调整会影响结果；Fig.3e, f显示蛋白质组重塑的早期迹象，后期时间点分析可能揭示后续后果；实验流程能检测细胞间通讯，但不排除部分配体-受体对也介导细胞内信号；人类数据源自慢性疾病样本，与小鼠急性炎症模型的比较受限。

总之，这项研究揭示了BBB处动态的、与人类生理相关的BEC-终足通讯通路，为在健康和疾病状态下研究BEC-星形胶质细胞交互作用提供了强大的方法学和丰富的数据资源，深化了对周围-大脑通讯分子机制的理解，并为感染等相关认知障碍的机制研究和潜在治疗靶点开发提供了新的视角。