CXCL8介导巨噬细胞迁移在犬口腔恶性黑色素瘤中的作用及靶向治疗潜力

《Scientific Reports》：CXCL8 mediates macrophage migration in canine oral malignant melanoma

本研究针对犬口腔恶性黑色素瘤（OMM）中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润机制不清的问题，通过RNA-seq、免疫组化及迁移实验，首次发现CXCL8是介导巨噬细胞迁移的关键趋化因子。CXCL8基因敲除或中和抗体均显著抑制巨噬细胞迁移，而外源重组CXCL8可逆转此效应，表明靶向CXCL8或为犬黑色素瘤提供新型治疗策略。

　　

犬口腔恶性黑色素瘤（OMM）是犬类最常见的恶性口腔肿瘤，占所有口腔肿瘤的14.4%至45.5%。尽管手术和放疗是主要治疗手段，但转移性病例预后极差。近年来，虽然犬黑色素瘤疫苗ONCEPT和抗PD-1抗体gilvetmab等系统性疗法逐渐应用，但其最佳治疗方案尚未明确。在人类医学中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）浸润与黑色素瘤的不良预后密切相关，然而犬类OMM中TAM的浸润机制仍不清楚。因此，探究犬OMM中巨噬细胞的趋化机制，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

本研究通过分析公共RNA-seq数据、免疫组织化学染色及体外迁移实验，系统评估了犬OMM中巨噬细胞浸润的特征及其调控机制。研究发现，犬OMM组织中多种巨噬细胞相关基因（如CCL2、CCL3、CXCL8）表达显著上调，且CD204阳性M2型巨噬细胞浸润明显增加。进一步通过Transwell迁移实验证实，犬黑色素瘤细胞条件培养基可诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7和犬巨噬细胞系DH82迁移，且迁移能力与CXCL8的表达水平呈正相关。通过CRISPR/Cas9技术敲除CXCL8基因或使用抗CXCL8中和抗体，均能显著抑制巨噬细胞的迁移能力，而外源添加重组CXCL8蛋白则可逆转基因敲除导致的迁移抑制。这些结果首次揭示CXCL8在犬OMM中介导巨噬细胞迁移的关键作用，为靶向CXCL8的免疫治疗提供了理论依据。

研究主要采用以下关键技术：基于公共数据库PRJNA527141的RNA-seq重分析、免疫组化（CD204和Iba-1染色）、实时荧光定量PCR（qPCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、CRISPR/Cas9基因敲除、Transwell迁移实验及蛋白质印迹（Western blot）验证。所有实验均使用临床来源的犬OMM组织样本（n=21）和正常口腔黏膜组织（n=6）。

结果

犬OMM中巨噬细胞相关基因表达高于正常口腔黏膜

RNA-seq重分析显示，与正常黏膜相比，OMM组织中多数巨噬细胞相关基因（如CCL2、CCL3、CXCL8）表达显著上调，提示巨噬细胞在肿瘤微环境中可能活跃浸润。

CD204阳性巨噬细胞浸润OMM组织

免疫组化结果显示，OMM组织中CD204阳性M2型巨噬细胞数量显著多于正常组织，而Iba-1阳性泛巨噬细胞数量无显著差异，表明OMM中M2型巨噬细胞特异性富集。

黑色素瘤条件培养基促进RAW264.7细胞迁移

除CMGD2外，其余6种犬黑色素瘤细胞系的条件培养基均能显著诱导RAW264.7细胞迁移，且迁移能力因细胞系而异。

CXCL8表达与巨噬细胞迁移正相关

在评估的6种趋化因子中，仅CXCL8的mRNA和蛋白表达水平与巨噬细胞迁移数呈正相关，其中蛋白水平的相关系数更具显著性。

CXCL8基因敲除或中和抗体抑制巨噬细胞迁移

敲除CXCL8基因或使用抗CXCL8中和抗体后，RAW264.7和DH82细胞的迁移均显著减少，证实CXCL8是关键的巨噬细胞趋化因子。

外源CXCL8蛋白逆转迁移抑制

在CXCL8敲除细胞的条件培养基中添加重组CXCL8蛋白，可显著恢复巨噬细胞的迁移能力，进一步验证CXCL8的功能特异性。

讨论与结论

本研究首次揭示CXCL8在犬OMM中作为巨噬细胞趋化因子的核心角色。尽管小鼠缺乏CXCL8同源基因，但其表达CXCR1/CXCR2受体，可能介导了跨物种的CXCL8功能。研究局限性包括未评估CXCR1/2阻断效应及M1/M2标志物的全面分析。未来需结合临床预后数据，深入探索CXCL8-CXCR1/2轴作为治疗靶点的潜力。综上，靶向CXCL8可能成为改善犬OMM免疫微环境及预后的新策略。