小鼠视觉皮层发育过程中持续的细胞类型多样化

《Nature》：Continuous cell-type diversification in mouse visual cortex development

单细胞转录组和表观组分析揭示了小鼠视觉皮层从胚胎期到成年的动态细胞类型图谱，构建了包含714个亚类的高分辨率发育轨迹，明确了神经发生、迁移和分化过程中细胞类型的时空特异性变化，并鉴定了关键调控因子和基因网络。眼开放及临界期显著促进细胞多样性分化，形成功能特异的神经网络。

　　在哺乳动物大脑的皮层中，细胞类型的高度多样性是其复杂功能和灵活行为的基础。这一区域的发育过程涉及一系列严格的时间调控事件，从胚胎发育到出生后成熟。单细胞转录组学技术为研究整个发育过程中细胞类型提供了系统性的视角。本文介绍了一项关于小鼠视觉皮层的全面、高分辨率的转录组学和表观遗传学细胞类型图谱，结合了568,654个高质量单细胞转录组和200,061个高质量单核Multiome数据集，覆盖了从胚胎第11.5天（E11.5）到出生后第56天（P56）的发育阶段。通过计算分析，研究人员重建了所有兴奋性、抑制性和非神经元细胞类型的转录组学发育轨迹图，并识别了细胞类型出现的关键节点和分子特征。该轨迹图显示，在胚胎阶段，神经发生、胶质细胞生成和早期后分裂成熟以一种交错并行的方式产生所有细胞类别和几乎所有子类别。出生后，随着发育的推进，细胞类型逐渐精细化，包括许多在眼睛开启阶段和关键期出现的细胞类型，这表明皮层发育过程中存在持续的细胞类型多样化。

皮层细胞的类型可以基于多种细胞特性来定义，如基因表达、形态、生理学、连接性等。过去十年，单细胞转录组学为皮层细胞类型分类提供了详尽且精确的分类，定义了大约100种转录组学细胞类型（T-type），并且这些分类在不同皮层区域和物种之间（例如从小鼠到人类）具有显著的一致性。T-type可以进一步组织成类和子类，反映了其多样的相关性，并可能与细胞类型的进化和发育历史有关。具体来说，在每个皮层区域中，定义了大约28个细胞子类：9个谷氨酸能兴奋性神经元子类、8个GABA能抑制性神经元子类、3个胶质细胞子类、3个免疫细胞子类和5个血管细胞子类。谷氨酸能子类是根据其所在层（L）和长距离投射模式进行组织的，如L2/3内在皮层投射（IT）、L4/5 IT、L5 IT、L6 IT、L6 Car3、L5/6近端投射（NP）、L6皮层丘脑投射（CT）和L6b。GABA能子类则基于其发育起源进行组织，包括Lamp5、Sncg、Vip、Pvalb、Pvalb chandelier、Sst、Sst Chodl和Lamp5 Lhx6等。胶质细胞子类包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和少突胶质细胞前体细胞（OPCs），而免疫细胞子类则包括小胶质细胞、边界相关巨噬细胞（BAMs）和淋巴细胞。最后，血管细胞子类包括血管软脑膜细胞（VLMCs）、蛛网膜下腔细胞（ABCs）、内皮细胞、周细胞和平滑肌细胞（SMCs）。

为了对齐不同层次的转录组学细胞类型与形态、生理和连接性，研究人员使用了多模态整合方法。例如，使用Patch-seq技术，小鼠视觉皮层中的GABA能神经元被分为28种形态电生理-转录组学类型（MET-types），这表示相对于原始的61种T-types更粗略的分类，但每个MET-type在不同模态之间具有更高的一致性。通过计算局部树突和轴突形态的匹配，研究人员能够将重建的神经元与来自光或电子显微镜数据的长距离投射模式或突触连接性进行比对。此外，细胞类型特异性遗传工具、条形病毒和空间转录组学方法也被用来将转录组学身份与连接性或功能特性相关联。

哺乳动物皮层的发育已被广泛研究多年。现在已知谷氨酸能神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞是在背侧皮质（后来成为皮层）中产生的，而GABA能神经元则是在腹侧皮质（subpallium）中产生的，并沿着特定的路径迁移到皮层。免疫和血管细胞类型则起源于大脑之外。在背侧和腹侧皮质中，室管膜区（VZ）和侧脑室下区（SVZ）的前体细胞逐渐分化为放射状胶质细胞（RG）、中间前体细胞（IPs）和未成熟神经元（IMNs）。在胚胎阶段，不同层的谷氨酸能神经元被认为是按顺序产生的，并通过放射性迁移到达其目标层，形成一种由内向外的模式。出生后，所有细胞类型都经历了特定的成熟过程，包括谷氨酸能和GABA能神经元的树突和轴突分支、突触形成以及活动依赖的回路优化。特别是，视觉皮层经历了经验独立和经验依赖的回路发展，以获得更精细的视觉反应特性。

尽管对哺乳动物皮层发育过程和机制的理解取得了显著进展，但仍存在许多空白。例如，我们仍不清楚特定细胞类型身份的确立时间，以及成年皮层中观察到的细胞类型是否在胚胎阶段就已经确立，以及谱系分支决策是如何发生的。在出生后的发育过程中，许多过程同时进行，且时间重叠。这些过程包括内在神经元活动、外部感觉输入的影响、长距离连接的形成与消失、局部兴奋性和抑制性回路模式的形成，以及神经元和非神经元细胞之间的相互作用。因此，细胞在发育过程中经历了快速的状态转换。尽管已经发现了许多参与这些过程的基因、蛋白质和表观遗传特征，但我们对细胞类型特异性事件及其动态、细胞类型特异性回路的形成以及驱动细胞类型和回路成熟的机制仍知之甚少。为了解决这些问题，有必要在单细胞水平上研究发育变化，并将这些变化与细胞类型特异性联系起来。

本文报告了小鼠视觉皮层发育过程中高时间分辨率的转录组学和表观遗传学细胞类型图谱。我们系统地识别了所有兴奋性、抑制性和非神经元细胞子类和聚类在视觉皮层中的精确时间点，并展示了细胞类型持续多样化的模式。我们还系统地分类了大量差异表达（DE）基因集和差异可及性（DA）染色质峰模块，这些基因集和模块与特定细胞类型和发育年龄同时相关。这些数据提供了与个体细胞类型和特定发育事件直接相关的实时动态分子图谱，有助于未来研究细胞类型和回路发育的分子逻辑。

为了构建发育轨迹，我们首先使用了最近建立的成年小鼠全脑转录组学分类（ABC–WMB图谱）作为参考，将成年细胞类型身份传播到较年轻的细胞中，通过按顺序进行细胞类型标签转移。对于胚胎时间点，我们将其映射到先前研究的发育小鼠脑scRNA-seq参考图谱，以识别广泛的细胞类型。通过使用组合标记基因，我们进一步分类了这些簇为神经上皮细胞（NECs）或RG，其中RG来源于NECs。之前的研究所示，IPs到IMNs再到成熟皮层兴奋性神经元存在一个转录组学连续体。因此，我们使用了一组组合标记基因来分配簇到这些类别。我们还定义了前板Cajal-Retzius（CR）细胞和胶质母细胞。

在迭代的从头聚类和合并后，我们进行了进一步的注释并识别并移除了逃过初始质量控制过程的“噪声”子簇或可能来源于皮层之外的子簇。这一步骤结果为最终的568,654个高质量单细胞转录组，形成714个子簇。作为注释的一部分，我们将早期发育年龄的数据与三个外部数据集整合，使用scVI算法进行分析。我们的细胞类型分配在子类水平上与先前研究结果基本一致，同时提供了更精细的细胞类型和时间分辨率，增加了簇和子簇的注释。

我们通过一个高分辨率的转录组学细胞类型分类，呈现了成人和发育中的小鼠视觉皮层的复杂分子关系，这些分类在树状图和统一曼菲斯特近似与投影（UMAP）图中进行了可视化。该分类包括四个嵌套层次：15个类、40个子类、148个簇和714个子簇。它涵盖了文献中提到的所有已知神经元和非神经元细胞类别，并且发现了许多过渡细胞类型和子类型。我们还生成了6,724个差异表达基因列表，这些基因区分了所有簇和子簇。

在IT Glut类中，我们识别了早期和晚期的染色质峰-基因对，这些对与基因表达模式相关。例如，IT Glut的早期峰模块与IMN IT子类相关，而晚期峰模块则与L2/3 IT、L4/5 IT、L5 IT和L6 IT子类相关。此外，许多标志基因的表达模式在不同子类和时间点显示出微妙但重要的差异。例如，虽然Tbr1表达通常在神经发生过程中增加，但其表达在IT神经元成熟过程中逐渐减少，特别是在L2/3子类中。在非IT Glut类中，L6b子类的早期标志基因是Hs3st3b1，而晚期标志基因是Moxd1和Cplx3，这些标志基因在不同子类和时间点的表达模式显示了细微的差异。这些结果揭示了细胞类型特异性与时间动态之间的紧密联系。

在GABA能神经元中，我们发现了与特定子类和时间点相关的染色质峰-基因对。例如，Lamp5和Sncg标志基因的表达在胚胎晚期和出生后早期开始增加，并在不同子类和时间点中显示出显著的表达差异。这些结果表明，GABA能神经元的发育过程中存在复杂的调控网络，与细胞类型特异性相关。

在胶质细胞中，我们发现了与特定子类和时间点相关的染色质峰-基因对。例如，星形胶质细胞的标志基因Gfap、Aqp4、Aldh1l1和Slc1a3在不同时间点中显示出不同的表达模式。这些结果表明，胶质细胞的发育过程中存在多种调控机制，与细胞类型特异性相关。

通过这些研究，我们发现细胞类型特异性基因表达和染色质可及性在特定细胞类型中存在合作性的动态变化。我们识别了细胞类型特异性且时间解析的基因调控网络，这些网络通过可及性染色质基序将转录因子和下游目标基因联系起来。这些数据为未来研究细胞类型和回路发育的分子逻辑提供了详细的动态分子图谱。

在眼睛开启阶段，我们观察到了细胞类型多样性的显著增加。为了量化多样性，我们绘制了不同子类在同步年龄中的总簇数和子簇数（图5a）。簇数随着发育时间的推移持续增加，尤其是在P11–P13和P19–P21时间点出现跳跃。在子簇水平上，多个子簇数的增加表明在不同时间点上过渡细胞亚型或状态的异质性增加，这些异质性与特定的发育事件相关。这些事件包括神经发生、轴突生长和突触形成、眼睛开启和经验依赖的关键期等。

在眼睛开启和关键期后，我们观察到了广泛的细胞类型特异性基因表达变化和激活的染色质可及性峰（图5b和5d）。基因表达的变化在不同细胞类型中显示出显著的差异，表明这些变化可能是由外部视觉信息的输入、内在回路的成熟或两者的相互作用引起的。未来的研究可以在正常发育或感觉剥夺的条件下进行，以进一步揭示这些因素的贡献。

在眼睛开启前，我们观察到了细胞类型特异性基因表达和染色质可及性峰的显著变化。这些变化可能反映了神经元活动对基因表达的调控，从而帮助回路的形成和优化。这些结果表明，细胞类型特异性基因表达的变化在眼睛开启后变得更加显著，并且可能与经验依赖的回路发育有关。

在发育过程中，我们还发现了细胞类型特异性基因调控网络（GRN）的复杂性。这些网络由主要的转录因子家族，如bHLH、MEF2、SOX、POU、AP-1和许多核受体（如Nr4a2、Rora、Rorb、Nr2f2、Esrrg和Nr3c2）构成。核受体在细胞类型特异性中起关键作用，它们能够将外部信号转化为细胞类型特异性转录反应。它们能够结合特定的DNA基序，根据配体的存在或细胞状态招募共激活因子或共抑制因子，并能够动态响应时间变化，从而精确调控基因表达。

在眼睛开启阶段，我们观察到了广泛的细胞类型特异性基因表达变化和激活的染色质可及性峰。这些变化不仅涉及神经元，还包括非神经元细胞类型。基因表达的变化可能反映了神经元活动对基因表达的调控，从而帮助回路的形成和优化。这些结果表明，细胞类型特异性基因表达的变化在眼睛开启后变得更加显著，并且可能与经验依赖的回路发育有关。

在发育过程中，我们还发现了细胞类型特异性基因调控网络（GRN）的复杂性。这些网络由主要的转录因子家族，如bHLH、MEF2、SOX、POU、AP-1和许多核受体（如Nr4a2、Rora、Rorb、Nr2f2、Esrrg和Nr3c2）构成。核受体在细胞类型特异性中起关键作用，它们能够将外部信号转化为细胞类型特异性转录反应。它们能够结合特定的DNA基序，根据配体的存在或细胞状态招募共激活因子或共抑制因子，并能够动态响应时间变化，从而精确调控基因表达。

此外，我们还发现了细胞类型特异性基因调控网络（GRN）的复杂性。这些网络由主要的转录因子家族，如bHLH、MEF2、SOX、POU、AP-1和许多核受体（如Nr4a2、Rora、Rorb、Nr2f2、Esrrg和Nr3c2）构成。核受体在细胞类型特异性中起关键作用，它们能够将外部信号转化为细胞类型特异性转录反应。它们能够结合特定的DNA基序，根据配体的存在或细胞状态招募共激活因子或共抑制因子，并能够动态响应时间变化，从而精确调控基因表达。

通过这些研究，我们不仅揭示了细胞类型特异性基因表达和染色质可及性在特定细胞类型中的动态变化，还识别了调控这些变化的转录因子和染色质峰。这些发现有助于理解细胞类型和回路发育的分子机制，以及这些机制如何协调发育过程中的不同阶段。