综述：模块化聚酮合酶的结构洞察：从单个结构域到超分子组装体

《Bulletin of the Korean Chemical Society》：Structural insights into modular polyketide synthases: From individual domains to supramolecular assemblies

本文综述了聚酮合酶（PKS）的结构域组成与功能，包括KS、AT、ACP、KR、DH和ER的作用机制。通过冷冻电镜技术揭示了PKS模块化组装及相互作用的新 insight，如docking域和连接器的作用。讨论了结构生物学如何指导PKS工程，解决传统工程中的限制，并展望了AI与结构生物学结合的未来应用。

　　聚酮合酶（Polyketide Synthases, PKSs）是生物合成多样化的天然产物的关键酶，这类天然产物广泛存在于微生物中，具有抗菌、抗肿瘤和免疫抑制等生物活性，其中许多具有重要的药物价值。PKSs在结构上是一个复杂的酶复合体，由多个功能域组成，这些功能域按照类似流水线的模式进行协同作用，共同完成聚酮链的合成与修饰。特别是在模块化PKSs（mPKSs）中，每个模块都包含一系列催化功能域，它们在基因簇中被编码，用于逐步构建特定的代谢产物。近年来，冷冻电镜技术的突破使得对mPKSs的高分辨率结构分析成为可能，这为理解其分子机制提供了关键线索，并支持了结构导向的工程化研究。本文旨在介绍mPKSs的个体功能域结构及其整体架构，揭示其结构多样性如何影响早期工程化尝试的局限性，并提出更有效的代谢重编程策略。

微生物产生的次级代谢产物，包括多种具有强大生物活性的化合物，如细胞毒性、抗肿瘤和抗菌作用，广泛应用于制药和工业领域。这些化合物通常由专门的生物合成基因簇（BGCs）编码，这些基因簇中的酶负责合成特定的代谢产物。根据化学性质和生物合成策略，天然产物被分为几个类别。在过去几十年中，许多有价值的天然产物的生物合成途径已被解析，并用于药物开发或工业用途。聚酮（PKs）作为其中一大类，具有广泛的临床应用，主要由于其抗菌或细胞毒性作用。聚酮合酶（PKSs）是合成聚酮的关键多功能酶，根据其功能域组织和生物合成逻辑分为I型、II型和III型。

I型PKSs由共价连接的功能域组成，这些功能域在合成过程中逐步延伸聚酮链。大多数细菌的I型PKSs是模块化的，每个模块在链延长过程中仅使用一次，而某些真菌的I型PKSs则通过重复使用同一功能域进行生物合成。例如，6-脱氧红霉素合酶（DEBS）合成红霉素的环状前体，是I型PKSs中最著名的例子之一。II型PKSs由离散的、单功能的酶组成，这些酶形成多酶复合体，催化聚酮链的迭代延伸。它们通常生成多环芳香化合物，如四环霉素C。III型PKSs，也被称为类黄酮合酶的PKSs，与I型和II型PKSs在结构和机制上不同。它们是同源二聚体，作为独立的酶起作用，催化聚酮链的迭代缩合反应，生成多种芳香聚酮。

在I型PKSs系统中，每个模块至少需要三个核心功能域进行链延伸：酮合酶（KS）、酰基转移酶（AT）和酰基载体蛋白（ACP）。ACP在翻译后被修饰为含有磷泛酰胺（ppant）的全酶，通过其灵活的臂末端与反应物和中间产物进行临时结合。AT功能域，无论是编码在模块内（cis-AT）还是由外部提供（trans-AT），负责选择特定的延伸单元，如丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）、甲基丙二酰辅酶A（methylmalonyl-CoA）或氨基丙二酰辅酶A（aminomalonyl-CoA），并将其负载到全ACP的ppant臂上。KS功能域则通过其保守的半胱氨酸残基形成的硫酯键接受上游的中间产物。AT向ACP的转移称为转酰化，而上游中间产物向KS的转移称为转位。随后，下游ACP将延伸单元攻击KS上的中间产物，通过脱羧的克莱森缩合反应实现链延伸。

β-酮基的进一步处理由β-酮还原酶（KR）、脱水酶（DH）和烯醇还原酶（ER）等功能域在同一个模块中完成。这些功能域通过其结构和功能的协同作用，将β-酮基逐步转化为β-羟基、β-烯基或完全饱和的两碳单位。最终，全链产物通过硫酯酶（TE）功能域从最后一个模块释放。尽管自1990年代以来，已有关于单个PKS功能域的高分辨率X射线结构报道，但由于其较差的结晶性，完整的PKS模块结构尚未被解析。这限制了早期的蛋白质工程研究，因为连接区、对接功能域和构象灵活性尚未被充分理解。然而，近年来冷冻电镜技术的突破，特别是所谓的“分辨率革命”，使得对整个PKS模块的结构分析成为可能，揭示了功能域组织、功能域间通信和构象灵活性的结构细节。

本文回顾了I型PKSs功能域的结构-功能关系，并介绍了最近关于模块和功能域间相互作用的结构研究，为这些复杂的酶机器提供了更深入的理解。虽然本文广泛讨论了I型PKSs功能域和模块的关键元素，但Grininger和Khosla团队的近期综述提供了更详细的机制视角以及对PKS生物学和工程学的全面覆盖。对于更深入理解PKS机制，我们建议读者参考这些综述。

在I型PKSs中，KS功能域通常作为核心结构，通过其二聚体结构介导整个合酶复合体的稳定性。KS功能域采用βαβα(β)αββ折叠结构，其二聚体界面包含广泛的极性和非极性相互作用，涉及抗平行β3链之间的氢键网络。在KS的催化活性位点中，转位和延伸反应发生在同一活性位点，而催化三联体（包括活性位点的半胱氨酸和两个邻近的组氨酸残基）有助于反应的进行。活性位点的氧烷离子洞，由催化半胱氨酸和一个附近的保守疏水门控残基（通常是苯丙氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸）形成，稳定了反应中的氧烷四面体中间体。门控环中含有高度保守的GFGG基序，并在适当前体加载时关闭活性位点，从而确保反应的准确性。此外，活性通道的内衬也对底物特异性起重要作用，特别是关于中间产物的链长和立体化学。

值得注意的是，存在不典型KS功能域，它们不催化链延伸。例如，许多cis-AT PKS途径包含一个加载模块作为第一个模块，其中含有一个被称为KS_Q的KS样功能域，其结构中包含一个谷氨酰胺残基，替代了保守的催化半胱氨酸。该功能域催化起始单元的脱羧反应，从而为整个系统提供启动信号。此外，还有其他不典型的KS功能域，它们执行独特的反应，如环化和水解、酯形成、C-N键形成和迈克尔加成反应。

AT功能域由一个大的α/β-水解酶（ABH）折叠亚结构域和一个较小的铁氧还蛋白样亚结构域组成。活性位点位于这两个亚结构域之间的深沟中，包含多个进化上保守的序列基序，这些基序对于催化和底物特异性至关重要。催化丝氨酸残基位于高度保守的GHSXG基序中，直接位于底物结合口袋上方。一个保守的组氨酸残基靠近该丝氨酸，作为广义的酸/碱催化剂，通过氢键网络促进丝氨酸的亲核攻击。在酰化丝氨酸后，酰基基团通过一个两步乒乓双底物机制转移到ACP功能域上。在一些AT功能域中，特别是在处理非天然底物时，AT功能域的工程化策略已被用于改变延伸单元的特异性。然而，这些策略的成功实施需要精确的结构理解，以保持底物识别和功能域间兼容性。

连接域（LD）是连接KS和AT功能域的α螺旋亚结构域，其作用不仅限于支架功能，还在一些PKS结构中显示出其他重要作用。例如，在Lsd14结构中，LD提供了AT-ACP的结合界面，参与底物识别。在trans-AT模块中，LD可能作为对接功能域，对于底物特异性起关键作用。在Brevibacillus brevis的孤儿生物合成基因簇11（BGC11）的双模块结构中，LD促进了相同模块之间的横向相互作用，有助于形成类似细胞器的大型复合体。Mabesoone等人在trans-AT PKS模块的C末端发现了一个保守的基序，对于PKS工程化具有重要价值。随着更多生物信息学和结构研究的开展，LD的作用和应用将进一步扩展。

ACP功能域在聚酮链的合成过程中起到关键作用，它在酶功能域之间穿梭，传递正在增长的酰基链。ACP通常由四个α螺旋组成，通过多个螺旋间的疏水相互作用稳定其结构。催化丝氨酸残基位于第二个α螺旋的N端，处于DS(I/L/V)基序中，并通过磷泛酰胺化形成全ACP。ACP与非核糖体肽合成酶（NRPSs）的肽载体蛋白（PCP）域在结构上相似，它们在NRPS系统中执行类似的功能。尽管PKS和NRPS域之间的直接相互作用较为罕见，但交叉域结合事件，如ACP与NRPS模块的结合或PCP与PKS模块的结合，已被报道。这些发现强调了ACP作为多功能交互平台的作用，支持了混合NRPS-PKS生物合成系统。

为了保护其携带的反应中间体，ACP可以通过其结构将疏水的酰基链封闭在一个特定的腔室中，这一现象称为ACP封闭（sequestration）。这种封闭通常涉及第三个α螺旋的构象变化，扩大一个可以容纳底物的疏水腔室。ACP封闭不仅稳定了ACP-底物复合物，还防止了底物在转移过程中发生水解或其他副反应。这种机制在II型PKS系统中尤为明显，其中ACP作为独立的蛋白质存在于细胞质中，比模块结合的ACP更持久。有趣的是，人类线粒体ACP也源自吞噬的原核生物，并利用离散的II型ACP实现酰基链的封闭。

KR功能域是PKSs中第一个还原功能域，它将β-酮基转化为β-羟基，使用NADPH作为电子供体。KR功能域通常由两个亚结构域组成：N端的非催化/结构亚结构域（KR_s或?KR）和C端的催化亚结构域（KR_c或KR）。这两个亚结构域均采用罗斯曼折叠结构，包含两个右旋α-β-α-β-α基序，这一特征在短链脱氢酶/还原酶（SDR）酶家族中也存在。NADPH结合在这些基序之间的保守沟槽中，这一位置在KR结构中也可见。KR功能域的活性位点包含一个高度保守的丝氨酸-酪氨酸-赖氨酸三联体，其中赖氨酸残基位于C端，参与催化反应。KR功能域的立体控制与保守的序列基序相关，通过结构和生物信息学研究揭示了这些基序的作用。

DH功能域催化β-羟基酰基中间体中水的去除，形成α,β-双键。I型DH功能域采用保守的双热狗（DHD）折叠结构，其中弯曲的β片层包裹一个中心的α螺旋。活性位点包含一个组氨酸-天冬氨酸催化二联体，每个来自不同的亚结构域。组氨酸位于保守的HXXXGXXXXP基序中，作为广义的碱，与末端的脯氨酸通过局部骨架弯曲形成咪唑-吡咯烷堆积。天冬氨酸来自保守的DXXX(Q/H)基序，位于组氨酸的对面，以完成催化二联体。DH功能域的催化组氨酸-天冬氨酸二联体可能通过不同的机制模型催化水的去除，例如经典的双碱模型或替代的单碱模型。

另一个保守的基序LPFXW被认为介导DH与KR或ACP功能域之间的功能域间相互作用。最近的DH-ACP复合物结构研究证实了这种相互作用，强调了其在功能域通信中的作用。尽管反应平衡倾向于水合中间体，下游的KS或TE功能域通过热力学驱动反应向脱水方向进行。

ER功能域催化NADPH依赖的α,β-双键的还原，生成完全饱和的两碳单位。ER功能域采用中链脱氢酶/还原酶（MDR）折叠结构，具有一个中央β片层，两侧由α螺旋构成，这一结构特征与罗斯曼折叠类似，支持NADPH的结合。虽然KR和ER功能域都使用罗斯曼折叠结构，但它们的底物结合口袋、二聚化界面和催化残基存在显著差异，反映了不同的催化机制和底物特异性。

整体上，这些结构表明，尽管许多mPKSs的结构与FASs和迭代PKSs相似，但功能域的排列和对称性存在显著变化。这些差异可能通过调节ACP轨迹、功能域间相互作用和催化时间来影响矢量处理和反应特异性。

在模块间的相互作用方面，精确的模块间通信对于确保目标代谢产物的正确合成至关重要。已知的对接功能域（DDs）是促进模块间相互作用的关键策略，例如在DEBS2-DEBS3和PikAIII-PikAIV界面中。这些相互作用涉及互补的功能域：上游模块的ACP的C端对接功能域（CDD）和下游模块的N端对接功能域（NDD）。CDD通常由三个α螺旋组成，其中两个形成模块内二聚化界面，第三个与下游的NDD直接相互作用。NDD通常由一个α螺旋构成。当两个DDs结合时，它们形成一个四螺旋束（4HB）结构，具有螺旋-折叠-螺旋的特征。4HB通过特定的疏水和静电相互作用确保模块的准确识别。

此外，一个关于孤儿BGC11的最新研究揭示了一个双模块核心结构，该结构以丝状组装形式存在。在该丝状结构中，KS3-DH3-ACP-KS4片段通过KS和DH功能域的相互作用形成同源二聚体，类似于MAS-like和LovB复合物。模块间的相互作用由DH3二聚体介导，连接KS3和KS4二聚体。值得注意的是，DH3二聚体表现出高度的旋转灵活性，这可能妨碍了精确的结构解析，但有助于ACP的移动性。每个双模块核心通过连接域（LD）与相邻的核心横向连接，这一结构表明模块间相互作用可以在没有明确DDs的情况下发生，说明模块间相互作用的高度多样性。

虽然上述对接相互作用发生在模块之间，但还有其他元素连接模块内的功能域，特别是在这些功能域由不同多肽编码的split模块中。这种split连接在trans-AT系统中较为常见，涉及多种功能域组合，包括KS-DH、KS-KR、DH-KR和ACP-ER。例如，在macrolactin合酶中，多个split连接存在于其BGC中。其中，MlnE的N端对接功能域（NDD）与MlnKR6之间的相互作用通过X射线晶体学进行了表征。尽管该连接发生在KS和KR功能域之间，但其结构折叠类似于VirA的C端对接功能域和VirFG的N端对接功能域的4HB结构。另一个例子来自gladiolin的生物合成，其中GbnD4和GbnD5亚基形成KS和DH功能域之间的split连接。GbnD4的KS功能域包含一个之前未注释的C端延伸，与下游的DH功能域相互作用，这一区域现在被称为DH对接（DHD）功能域。生物信息学分析显示，类似的DHD基序在许多trans-AT PKSs的KS-DH连接处保守存在。生化实验，包括酰基转移、交联、卡宾足迹分析和NMR，表明DHD是一种内源性无序肽，能够特异性识别其对应的DH，并在保持装配线保真度方面起关键作用。与4HB介导的连接不同，这种机制采用短线性基序（SLiMs），这一策略也见于其他装配线酶系统。

在结构导向的PKS工程化方面，近年来的进展表明，结构生物学为理性设计提供了不可或缺的指导。例如，在DEBS6工程化以接受氟化丙二酰辅酶A底物的过程中，AT功能域的替换基于DEBS M6晶体结构和同源模型。此外，通过进化共变分析发现的新基序位于连接域的C端，并通过结构映射明确了其作为功能性嵌合trans-AT PKSs的连接点的作用。在另一个案例中，通过将硫还原酶（TR）功能域附加到rimocidin和lavendiol PKS模块上，实现了中链和支链二醇的合成，这些二醇是重要的工业溶剂。这一设计策略不仅依赖于现有的结构信息，还通过TR-ACP结合界面的结构预测得到了支持。这些案例说明了结构信息如何作为分子蓝图，扩展PKSs的催化多样性。

尽管这些案例主要涉及使用结构信息来定义基序或功能域边界，但结构信息也可直接用于调节关键的酶活性，包括底物特异性和反应动力学。展望未来，将实验结构、进化分析和AI驱动的结构预测（如AlphaFold）与蛋白质设计相结合，有望加速开发具有更高效率和新颖化学输出的定制化PKSs。然而，目前的AI算法在捕捉构象动态、模块间灵活性和底物诱导的重排方面仍有局限。因此，虽然AI预测可以补充实验结构生物学，但其应用效果将最大化的前提是与冷冻电镜、晶体学和生化验证相结合。总体而言，结构导向的策略不仅是当前PKS工程化的补充，更是未来理性设计的核心。

天然产物的临床价值及其合成机制持续推动对PKSs的工程化研究，以生产有效的治疗化合物。然而，尽管已有数十年的尝试，由于缺乏结构指导，工程化策略仍取得有限成功。近年来，冷冻电镜技术的突破使得对多种PKS大合酶的高分辨率结构解析成为可能。本文回顾了个体PKS功能域的结构特征及其由模块组织产生的更高阶架构，揭示了模块间相互作用的机制。工具如抗体片段和化学交联剂能够捕捉弱或瞬时的构象，为PKS反应机制提供了见解。这些成果揭示了mPKSs的方向性和特异性关键决定因素，为更精细的工程化策略铺平了道路。

然而，仍然存在许多未解的问题，包括ACP如何在不同模块中与PKS功能域相互作用，以及PKS模块如何在体内协作。解决这些问题需要采用时间分辨冷冻电镜技术捕捉瞬时状态，或利用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）可视化细胞中的大复合物。同时，基于人工智能的蛋白质设计工具在定制PKSs以生产有价值的PKs方面也展现出巨大潜力。我们相信，将基础结构研究与新兴的人工智能技术相结合，将有助于下一代PKS工程的发展。