生物介质pH值对壳聚糖/peGFP-C3聚电解质复合物稳定性和基因传递效率的影响

《Macromolecular Symposia》：Influence of Biological Medium pH on the Stability and Gene Delivery Efficiency of Chitosan/peGFP-C3 Polyelectrolyte Complexes

本研究考察了壳聚糖/peGFP-C3复合体在pH6.5和7.1条件下的稳定性及转染效率，发现pH6.5时转染效率最高，但导致细胞周期S期积累和增殖受阻，而pH7.1提高细胞存活率。实验表明pH对复合体稳定性、转染效率和细胞生理状态具有关键影响。

　　在基因传递领域，天然和合成的多阳离子材料被广泛用于DNA和RNA的转染，因为它们能够有效地将核酸材料包裹起来，防止其降解，并促进其进入细胞。尽管这些复合物的形成机制已被充分研究，但其在细胞外和细胞内的稳定性却鲜有系统探讨。在众多多阳离子材料中，壳聚糖作为一种具有生物降解特性的天然多糖，因其可调控的理化特性，尤其是其对pH值的高度敏感性，被寄予厚望。然而，壳聚糖的pKa值约为6.5，这意味着在接近该pH值的环境中，其电离状态会受到显著影响，从而影响其与核酸的相互作用。

为了更深入地理解这种影响，本研究通过考察不同pH条件对壳聚糖/peGFP-C3复合物稳定性的影响，以及这些条件对HEK293T细胞存活率、增殖能力和转染效率的影响，探讨了pH在优化基因传递中的作用。研究结果表明，在pH 6.5的条件下，壳聚糖/peGFP-C3复合物的转染效率最高，随后在pH 7.1的培养基中进行中和处理，尤其是使用高分子量壳聚糖时，效果尤为显著。这表明在特定pH环境下，壳聚糖能够更有效地与核酸结合，从而提高其传递效率。

然而，细胞存活率在pH 7.1的条件下更高，而酸性环境（pH 6.5）则对细胞增殖产生不利影响，导致细胞周期停滞在S期，这可能意味着酸性条件干扰了细胞的正常生长和分裂过程。这一现象揭示了pH在基因传递过程中的双重作用：一方面，它有助于维持复合物的稳定性，另一方面，过低的pH可能对细胞的生理状态造成损害。

在实际应用中，壳聚糖的pH敏感性既是优势也是挑战。在较低的pH条件下，壳聚糖的正电荷会增强，从而更有效地与带负电的DNA结合，形成稳定的复合物。这种特性使得壳聚糖在酸性环境中表现出较高的转染效率。然而，生理条件下的pH值通常高于6.5，这会导致壳聚糖发生沉淀，进而影响其在体内的传递效果。相比之下，聚乙烯亚胺（PEI）在生理pH条件下能够保持较高的稳定性，因此其转染效率通常优于壳聚糖。

为了解决壳聚糖在生理pH条件下稳定性不足的问题，研究者提出了一种pH调控策略，旨在提高壳聚糖为基础的基因传递载体的稳定性和效率。这一策略的核心在于利用pH对复合物溶解性、聚集行为和整体生物功能的影响。通过在不同生物缓冲液（如MES和HEPES）中进行实验，研究者观察到壳聚糖/peGFP-C3复合物的稳定性受到pH值的显著影响。MES缓冲液的pH值为6.5，而HEPES缓冲液的pH值为7.1，这表明在酸性条件下，复合物的稳定性更高，而在中性或碱性条件下，复合物可能更容易发生聚集或沉淀。

此外，研究还发现，壳聚糖的分子量（MW）对其与peGFP-C3复合物的稳定性具有重要影响。高分子量壳聚糖在酸性条件下表现出更强的结合能力，从而提高了转染效率。这可能是因为高分子量壳聚糖具有更大的表面积，能够与更多的DNA分子相互作用，形成更稳定的复合物。然而，当使用低分子量壳聚糖时，其转染效率则相对较低，这可能与分子量较小导致的电荷密度不足有关。

在评估这一策略时，研究者采用了多种方法，包括细胞存活率的测定、细胞增殖的研究以及转染效率的分析。细胞存活率的测定主要通过测量细胞内的ATP水平来进行，ATP是细胞代谢活动的重要指标，其含量的高低可以反映细胞的健康状况。研究结果显示，在pH 7.1的条件下，细胞的ATP水平更高，表明其存活率和增殖能力更强，而在pH 6.5的条件下，ATP水平显著降低，这可能意味着酸性环境对细胞的生理状态产生了负面影响。

细胞增殖的研究则通过观察不同pH条件下细胞数量的变化来进行。研究发现，低分子量壳聚糖（如45 kDa）在pH 6.5的条件下支持更高的细胞增殖率，而高分子量壳聚糖则在pH 7.1的条件下表现出更好的增殖效果。这可能是因为不同分子量的壳聚糖在不同pH条件下对细胞膜的相互作用不同，从而影响了细胞的生长和分裂。

进一步的分析还表明，pH值对细胞周期的影响显著。在pH 7.1的条件下，细胞表现出正常的周期分布，而在pH 6.5的条件下，细胞周期在S期发生累积，这可能意味着酸性环境干扰了细胞的正常分裂过程。这种现象提示我们，在使用壳聚糖进行基因传递时，需要特别关注pH值对细胞生理状态的影响，以确保其在体内环境中的安全性和有效性。

为了进一步验证这些发现，研究者还进行了细胞DNA含量的分析。通过检测细胞内的DNA水平，研究者可以了解pH值对细胞分裂和生长的影响。结果显示，在pH 7.1的条件下，细胞DNA含量正常，而在pH 6.5的条件下的DNA含量则有所下降，这可能与酸性环境对细胞分裂的抑制有关。

综上所述，本研究通过系统的实验设计和数据分析，揭示了pH值在壳聚糖/peGFP-C3复合物稳定性、细胞存活率、增殖能力和转染效率中的关键作用。这些发现不仅有助于优化壳聚糖为基础的基因传递载体，也为进一步研究pH对细胞生理状态的影响提供了理论依据。未来的研究可以进一步探讨不同pH条件下壳聚糖与其他核酸分子的相互作用，以及如何通过调控pH值来提高基因传递的效率和安全性。此外，还可以研究壳聚糖在不同生物环境中的稳定性，以确保其在体内应用中的可行性。