关于源自宏基因组的脲酶催化活性的研究见解

《Journal of the American Chemical Society》：Insights into the Catalytic Activity of a Metagenome-Derived Urethanase

聚醚脲降解酶UMG-SP2的催化机制研究表明，该酶通过QM/MM混合计算和实验验证，揭示其水解聚醚脲模型化合物4-硝基苯基苄基碳酰胺的三步酯酶样机制（酰化、水解、脱羧化），证实碱性环境对活性位点Lys75去质子化至关重要，并发现该酶在原子层面具有双重酶活性（酰胺酶和酯酶），为生物回收聚醚脲提供了新策略。

　　塑料是现代经济中不可或缺的材料，广泛应用于食品包装、现代医学、纺织品、建筑等多个领域。然而，随着塑料产量的激增，其难以降解的特性也引发了严重的环境问题。因此，寻找可持续、经济可行的解决方案成为解决塑料污染问题的关键。生物降解技术，尤其是使用高度选择性的酶进行降解，被认为是实现这一目标的有希望的替代方法。这些酶可以将消费后的塑料分解为可定义的分子片段，从而实现材料的再利用或升级回收为高价值产品。

聚氨酯（PUR）是一种广泛使用的多功能聚合物，其全球市场在2023年已超过2000万吨和780亿美元。尽管广泛应用于多个领域，但PUR的回收仍面临巨大挑战，主要是由于其复杂的结构和交联特性，使得机械回收变得困难，并且可能污染其他塑料废弃物。此外，PUR通常由不可再生资源制成，虽然其C–O和C–N骨架理论上具有低能垒的降解潜力，但现有的化学和酶催化回收方法仍然不成熟，且需要苛刻的条件。这使得PUR的选择性降解成为一项迫切但尚未解决的需求。

尿烷酶（urethanases）是一类能够催化尿烷键水解的酶，水解过程中释放出醇类、胺类和二氧化碳。1990年，Kobashi及其团队首次从鼠粪中分离出一种能够将尿烷分解为乙醇和氨的尿烷酶。此后，尿烷键的生物降解在很长一段时间内被认为不可行。直到最近，Bornscheuer团队从受PUR污染的土壤中发现三种尿烷酶（UMG-SP1、UMG-SP2和UMG-SP3），它们能够水解聚醚-聚氨酯的尿烷键，释放出芳香二胺。特别是UMG-SP2表现出在这一过程中的巨大潜力。随后，这些酶的晶体结构被公布，但直到2024年底才被公开。结构分析和分子动力学（MD）模拟显示，一个名为L3的柔性环对于尿烷酶的水解活性至关重要。

本研究聚焦于UMG-SP2的催化机制，使用4-硝基苯基苯甲基氨基甲酸酯（pNC）作为模拟物，以研究芳香型聚氨酯的尿烷键降解。尽管pNC缺乏常见的醇基团，并且在水中的溶解度较低，但其作为模拟物的选择主要基于计算上的考虑。pNC是一种小型的尿烷替代物，能够模拟聚氨酯中常见的芳香胺。此外，pNC在最近的研究中被用作筛选多种水解酶（如脂肪酶、蛋白酶、角质酶和尿烷酶）催化PUR热固性材料降解的模型化合物。通过使用小分子模型，我们能够在QM/MM模拟中完整包含分子，从而避免引入可能的误差源。同时，这种化合物便于通过UPLC-MS检测，为研究酶的活性提供了便利。

本研究采用QM/MM方法对pNC的水解机制进行了系统分析。通过AlphaFold2预测的高质量结构模型，我们构建了UMG-SP2的活性位点，并模拟了两种可能的底物结合方式，即促进C–O键断裂的酯酶活性和促进C–N键断裂的酰胺酶活性。在pH值为8的情况下，通过neMD/MC模拟，我们获得了活性位点赖氨酸（Lys75）的完整质子化曲线，表明尿烷酶需要碱性环境才能发挥活性。此外，我们发现Lys75在碱性pH下处于中性状态，这与酰胺酶家族中已知的机制一致，其中活性位点的丝氨酸被附近的赖氨酸通过第二个丝氨酸的介导而激活。

在QM/MM计算中，我们采用M06-2X DFT函数和6–31+G(d,p)基组来描述量子区域的原子，包括催化三联体Lys75、Ser150和Ser174，以及底物的羰基基团。通过计算自由能景观，我们揭示了UMG-SP2催化的水解过程遵循一个类似于酯酶的三步机制：酰化、水解和脱羧。每一步的自由能变化均表明其在动力学上是可行的。通过FEP方法，我们获得了每一步的自由能曲线，并与实验测得的转化频率（TOF）进行了比较，发现计算得到的自由能壁垒为21.2 kcal/mol，与实验测得的22.9 kcal/mol非常接近，说明计算结果与实验数据高度一致。

进一步的分析表明，底物在活性位点中的结合方式对于反应路径具有重要影响。我们发现，当底物采用Pose 2的结合方式时，其在活性位点中更为稳定，这表明UMG-SP2更倾向于酯酶活性。此外，我们还发现，底物中的某些键（如C–O或C–N）在不同结合方式下可能成为反应的突破口。通过对活性位点中关键距离的分析，我们确认了反应过程中形成氧离子洞（oxyanion hole）的必要条件，这一结构特征有助于稳定过渡态并降低反应能垒。

在化学反应步骤中，我们首先探讨了酰化阶段。该阶段涉及Ser174的脱质子化和对底物羰基碳的亲核攻击，以及C–O键的断裂。该步骤的自由能变化为-17.91 kcal/mol，表明其在热力学上是可行的。随后，我们研究了水解阶段，其中底物中的硝基苯醇离去基团被四个水分子取代，并通过Ser150和Lys75的协同作用完成反应。水解步骤的自由能变化为-11.1 kcal/mol，且其激活能为18.2 kcal/mol。此外，我们还分析了水分子在活性位点中的分布和取向，发现其数量在整个水解过程中保持稳定，尽管某些分子会与溶剂交换。

在脱羧步骤中，我们发现水解产物——氨基甲酸酯——可以在酶的活性位点中稳定存在，并且可能在酶的催化下完成脱羧反应。该步骤的激活能较低（12.1 kcal/mol），表明其在动力学上是可行的。然而，从热力学角度看，该反应是吸热的（9.1 kcal/mol），意味着其可能在没有酶参与的情况下自发进行。尽管如此，我们的计算结果表明，酶的活性位点可以为该步骤提供有利的环境，从而促进其发生。

实验验证进一步支持了我们提出的机制。通过在pH 10条件下进行pNC的水解反应，我们观察到苯甲胺的释放，且反应在18小时后达到平台期。通过UPLC-MS分析，我们检测到苯甲胺的浓度达到40 μM，这一结果与计算得到的自由能壁垒（21.2 kcal/mol）相符。实验测得的TOF为1.77 × 10^-4 s^-1，对应的自由能壁垒为22.9 kcal/mol，与计算结果略有偏差，这可能归因于实验条件中存在某些添加剂（如DMSO和Triton X-100）的影响。

本研究的结果不仅揭示了UMG-SP2在尿烷键降解中的作用机制，还为未来设计针对聚氨酯降解的生物催化剂提供了坚实的理论基础。通过构建和验证UMG-SP2的结构模型，我们发现该酶在碱性环境中表现出最佳活性，并且其催化三联体的结构和功能与已知的酰胺酶家族高度相似。此外，我们的研究还表明，通过调整酶的结构或反应条件（如pH、温度或添加辅助分子），可以进一步优化酶的催化效率。

总的来说，本研究通过计算和实验相结合的方法，深入探讨了UMG-SP2在聚氨酯降解中的作用机制。这不仅加深了我们对尿烷酶功能的理解，还为未来开发更高效的生物催化剂提供了重要的指导。通过模拟和实验的验证，我们确认了UMG-SP2的三步催化机制，并揭示了其在碱性条件下的最佳活性。这些发现为实现聚氨酯的可持续降解提供了新的思路，并展示了生物催化在解决塑料污染问题中的巨大潜力。