近红外光激活的DNA生物传感器：通过催化发夹结构组装信号放大策略实现miRNAs的灵敏检测

《ACS Omega》：Near-Infrared Light-Activated DNA Biosensor for Sensitive Detection of miRNAs via a Catalytic Hairpin Assembly Signal Amplification Strategy

血管钙化是维持性血液透析患者的常见并发症，检测相关miRNA-21对早期诊断具有重要意义。本研究构建了基于近红外光（NIR）激活的催化发夹组装（CHA）信号放大策略和上转换纳米颗粒（UCNPs）的DNA生物传感器，通过808 nm NIR光触发PC链接器断裂，释放探针H1与目标miRNA-21结合，进而启动CHA信号放大。实验表明，该传感器对miRNA-21的检测限低至0.25 nM，在血清样本中加标回收率96.7%-102.0%，且特异性强，能有效区分miRNA-21与相似序列（如mis-1）。该技术为复杂生物样本中低丰度miRNA的高灵敏检测提供了新方案。

　　在慢性肾功能衰竭的终末阶段，尿毒症成为一种常见的临床病症，而维持性血液透析（MHD）是目前治疗尿毒症的主要手段之一。然而，尽管MHD能够有效延长患者的生命，其引发的并发症仍十分普遍，其中血管钙化是最常见的问题之一。研究表明，尿毒症患者在血管钙化时，外周血中的微小RNA-21（miRNA-21）表达异常。因此，开发一种具有高灵敏度和特异性的miRNA检测方法，对于尿毒症患者早期筛查血管钙化并发症具有重要意义。基于这一背景，研究人员构建了一种基于近红外光（NIR）激活的DNA生物传感器，结合催化发夹组装（CHA）信号放大策略和上转换纳米颗粒（UCNPs），以实现对miRNA-21的高灵敏度和特异性检测。

该生物传感器的核心设计在于利用UCNPs的光转换特性，将NIR光转换为可见光（UV/Vis），从而激活DNA发夹结构。具体而言，研究人员将一种带有光裂解连接子（PC-linker）的DNA发夹（H1）修饰在UCNPs的表面，形成一种可被NIR光激活的探针。当NIR光照射到UCNPs上时，其内部的稀土元素（如Nd3?、Yb3?、Tm3?）能够通过能量转移机制产生UV光，进而引发PC-linker的断裂，使H1的“趾部”（toehold）区域暴露，从而与目标miRNA-21发生特异性杂交。与此同时，另一条带有Cy5和BHQ-2荧光标记的DNA发夹（H2）被设计为信号放大探针，其两端的荧光共振能量转移（FRET）机制在没有目标miRNA时会抑制荧光信号。一旦目标miRNA与H1结合，H2便可通过链置换反应释放miRNA，进而触发CHA信号放大过程，使Cy5与BHQ-2之间的距离增大，导致荧光信号从“关闭”状态（OFF）变为“开启”状态（ON），从而实现对miRNA-21的高效检测。

该方法的优势在于其利用了NIR光的低光损伤特性，避免了传统荧光探针对生物样本中天然荧光物质的干扰，同时通过CHA策略实现了信号的指数级放大，提高了检测的灵敏度。实验结果表明，该生物传感器对miRNA-21的检测限（LOD）为0.25 nM，远低于现有方法的检测水平。此外，该方法还成功应用于实际生物样本——血清中的miRNA-21检测，回收率在96.7%至102.0%之间，表明其在复杂生物样本中的稳定性和准确性。这一成果为尿毒症患者血管钙化并发症的早期诊断提供了新的技术手段。

从原理上看，该生物传感器的构建融合了纳米材料、DNA探针设计和光化学调控等多个领域。UCNPs作为关键的光学材料，因其独特的上转换发光特性而被广泛应用于生物传感领域。与传统的荧光探针相比，UCNPs具有更强的抗光漂白能力、更长的荧光寿命以及更小的光损伤，使其在生物体内具有更高的适用性。此外，UCNPs能够将NIR光转换为可见光，从而避免了生物样本中常见的紫外光背景干扰，显著提升了检测的信噪比。通过将这种光转换特性与DNA发夹组装策略相结合，研究人员成功构建了一个具有光控激活功能的生物传感器，其不仅能够实现对miRNA-21的高灵敏度检测，还具备良好的特异性，能够在复杂的生物环境中区分其他类似序列的miRNA。

在实验设计方面，该研究采用了多种表征手段来验证UCNPs的结构和性能。通过透射电子显微镜（TEM）观察，研究人员确认了UCNPs的形貌和尺寸，发现其核心纳米颗粒呈六边形结构，而核心-壳层结构的UCNPs则呈现杆状形态，表明其结构设计合理且具有良好的稳定性。X射线衍射（XRD）分析进一步证实了UCNPs的晶体结构，其特征峰与六方晶系NaGdF?的标准图谱一致，说明合成过程的成功。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）则用于检测UCNPs表面配体的改变，当使用柠檬酸进行配体交换后，FT-IR谱图中与OA配体相关的特征峰明显减弱，表明配体交换过程完成。紫外-可见吸收光谱（UV–vis）和Zeta电位测量则用于验证H1是否成功结合到UCNPs表面，结果显示，H1修饰后UV–vis吸收光谱中出现了新的260 nm吸收峰，Zeta电位也发生了显著变化，表明H1已被有效修饰。

为了进一步验证该生物传感器的功能，研究人员通过荧光光谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）实验评估了其在NIR光激活下的性能。实验结果表明，当UCNPs被NIR光照射并加入miRNA-21后，荧光信号显著增强，且随着miRNA-21浓度的增加，荧光强度呈现线性增长趋势。此外，PAGE实验显示，H1与miRNA-21结合后，能够释放H2并触发CHA信号放大过程，最终形成稳定的双链结构，进一步支持了该方法的可行性。同时，通过比较不同miRNA对H1和CHA信号的影响，研究人员验证了该传感器对miRNA-21的高度特异性，即使在存在其他类似序列的miRNA时，其荧光响应仍然显著低于空白对照，表明该方法能够有效避免交叉反应，提高检测的准确性。

在实际应用方面，该生物传感器被用于血清样本中miRNA-21的检测，实验结果显示其回收率较高，且检测结果与定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）方法一致，说明该方法不仅具有高灵敏度，还具备良好的重复性和可靠性。此外，该研究还优化了实验参数，包括NIR光照射时间、H1和H2的浓度等，以确保检测的最优性能。通过实验发现，当NIR光照射时间为20分钟时，荧光信号达到最大值，而H1和H2的最佳浓度分别为3.5 nM和45 nM。这些优化结果表明，该方法在实际操作中具有较高的可重复性和稳定性，适用于多种生物样本的检测。

综上所述，该研究通过结合NIR光激活和CHA信号放大策略，成功构建了一种新型的DNA生物传感器，用于miRNA-21的高灵敏度和特异性检测。这种方法不仅克服了传统miRNA检测方法在灵敏度和特异性方面的局限性，还避免了紫外光对生物样本的干扰，提高了检测的准确性。此外，UCNPs的使用使得该方法在生物体内具有更高的安全性和适用性，为尿毒症患者血管钙化并发症的早期诊断提供了新的思路和技术手段。未来，随着该方法的进一步优化和推广，有望在临床诊断和生物医学研究中发挥更大的作用。