利用本地生产的Trichoderma atroviride酶混合物对玉米废弃物进行糖化处理并生产乙醇

《ACS Omega》：Saccharification and Ethanol Production of Corn Wastes Using a Locally Produced Trichoderma atroviride Enzymatic Cocktail

本研究评估了白地霉（Trichoderma atroviride）HTM菌株通过固态发酵（SSF）制备的酶液在玉米芯和秸秆糖化中的效能。酶液含高活性β-葡萄糖苷酶（374.91 U/g）和木糖酶（920 U/g），经碱预处理后的玉米芯在分批发酵（35%固体负载）和添加1%吐温20表面活性剂后，总还原糖产量达30.37 g/L，较无表面活性剂提升91.4%。酒精发酵结果显示83.48%的理论乙醇转化率。研究表明，本地生产的白地霉酶液结合分批发酵和表面活性剂策略可有效提高纤维素水解效率和生物燃料产量。

　　本研究围绕利用一种自制的酶组合，由灰绿青霉菌（*Trichoderma atroviride*）HTM菌株通过固态发酵（SSF）制备，用于玉米芯（CC）和玉米秸秆（CS）的糖化过程，目标是实现第二代（2G）乙醇的生产。研究结果显示，该酶组合表现出高水平的β-葡萄糖苷酶（374.91 U/g）和木聚糖酶（920 U/g），表明其在纤维素和半纤维素的降解过程中具有较强的催化能力。β-葡萄糖苷酶在pH 4.5–5.0和50 °C的条件下表现出最佳的活性和稳定性，这些条件正好适用于木质纤维素的生物转化。在碱处理后的玉米芯和秸秆中，使用该酶组合进行糖化，获得了较高的还原糖释放量，其中在30 CBU/g（纤维素单位）和35%固含量的条件下，玉米芯的糖化产物中还原糖浓度达到了15.86 g/L。而在反应体系中加入1%的吐温20后，还原糖浓度进一步提升至30.37 g/L，相较于未加表面活性剂的糖化反应，提高了91.48%。随后，利用该糖化产物进行酒精发酵，得到了83.48%的理论转化率，说明该酶组合在生物燃料生产中具有较高的可行性。这些数据表明，使用*Trichoderma atroviride*作为低成本的酶来源，并结合分批补料模式与表面活性剂的应用，可以显著提高糖化和发酵效率，为木质纤维素生物转化技术提供了一种具有经济性和环境可持续性的新方案。

在木质纤维素生物精炼厂中，酶解是释放可发酵糖的关键步骤，这些糖可以进一步转化为第二代乙醇及其他生物产品。目前，大多数糖化过程使用商业酶组合，这些组合含有丰富的纤维素酶和半纤维素酶，能够协同作用，使生物质分解。纤维素酶包括内切酶（如CMCase）、外切酶（如avicelase）和β-葡萄糖苷酶，它们依次作用于纤维素的结构，最终将纤维素转化为单糖。而半纤维素酶如木聚糖酶和β-木糖苷酶则主要负责将木聚糖分解为木糖。这些酶的协同作用对于提高木质纤维素的转化效率至关重要。然而，商业酶的成本较高，这成为该技术大规模应用的主要障碍之一。因此，研究者开始探索利用本地微生物生产这些酶，以降低生产成本，提高经济可行性。

*Trichoderma*属菌株在纤维素酶和半纤维素酶的生产方面具有显著优势，其中*Trichoderma reesei*因其高产酶能力而被广泛用于工业应用。然而，关于*Trichoderma atroviride*的酶生产研究相对较少，尽管其在β-葡萄糖苷酶的生产方面表现出良好的潜力。固态发酵（SSF）作为一种高效的生产方式，已被证明可以有效利用农业废弃物，如小麦麸皮（WB）作为底物，从而减少对昂贵培养基的依赖，同时提高酶的产量。本研究中，选择WB作为底物，是因为其富含多糖（45%纤维素和29%半纤维素），并具有较高的蛋白质含量（15.8%），这有助于诱导酶的表达。此外，SSF技术能够实现高达10倍的成本节约，为生物转化提供了一种可持续的解决方案。

在本研究中，通过SSF培养*Trichoderma atroviride* HTM菌株，获得了较高的β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性。具体而言，β-葡萄糖苷酶的活性在第七天达到峰值（374.91 U/g），而木聚糖酶的活性则在第三天达到最高（920 U/g）。这种生产曲线表明，β-葡萄糖苷酶的合成具有一定的滞后性，但其最终的累积量远高于其他酶类，这可能与酶的协同作用有关。在SSF过程中，菌株能够持续地产生这些酶，为后续的糖化反应提供了丰富的酶源。相比之下，β-木糖苷酶的活性较低，这可能与其在糖化过程中的作用较弱有关，或者与培养条件不完全适配有关。研究还指出，β-葡萄糖苷酶在酸性pH（4.5–5.0）和中等温度（约50 °C）下表现出最佳的活性和稳定性，这与木质纤维素糖化过程的常规条件相符，进一步证明了其在工业应用中的适应性。

碱处理作为一种常用的预处理方法，已被广泛用于提高木质纤维素的可发酵性。通过碱处理，可以有效去除木质素，使纤维素暴露于酶的攻击之下。本研究中，碱处理后的玉米芯和秸秆表现出更高的糖化效率，这与木质素含量的显著降低密切相关。例如，碱处理后的玉米芯（PTCC）中木质素含量由15.59%降至9.72%，纤维素含量由33.12%提升至53.02%，而半纤维素含量也有所增加，从35.15%提升至43.08%。这种显著的去木质素效果，使得纤维素结构变得更加松散，提高了酶的接触效率，从而促进了糖的释放。研究还发现，当使用30 CBU/g纤维素和35%固含量的条件进行糖化时，碱处理后的玉米芯能够释放出最高的还原糖浓度（8.97 g/L），这表明该酶组合在高固含量条件下的表现尤为出色。

为了进一步提高糖化效率，本研究引入了分批补料模式（fed-batch hydrolysis）和表面活性剂（如吐温20）的辅助作用。分批补料模式能够有效减少高固含量带来的粘度问题和酶的非特异性吸附，同时维持反应体系的流动性，提高酶与底物的接触效率。实验结果显示，在35%固含量的条件下，分批补料糖化能够释放出15.86 g/L的还原糖，而加入吐温20后，还原糖浓度进一步提升至30.37 g/L，相较于未加表面活性剂的糖化反应，提高了91.48%。这一显著的提升表明，表面活性剂在减少非生产性酶吸附、改善酶的催化稳定性和提高纤维素可及性方面发挥了重要作用。此外，表面活性剂还能减少糖化过程中抑制物的生成，如乙酸、甲酸、糠醛（FF）和5-羟甲基糠醛（HMF），这些物质可能对后续的酒精发酵产生不利影响。研究发现，在加入吐温20后，FF和HMF均未被检测到，而乙酸和甲酸的浓度也显著降低，这进一步验证了表面活性剂在糖化过程中的积极作用。

酒精发酵是将糖化产物转化为乙醇的关键步骤，本研究中采用的商业酵母（*Saccharomyces cerevisiae* Y-904）在发酵过程中表现出良好的性能。在糖化产物中，加入吐温20后，发酵效率显著提高，最终得到了3.03 g/L的乙醇产量，葡萄糖的转化率达到88.66%，理论转化率则达到了83.48%。这一结果表明，糖化过程中产生的抑制物含量较低，为酵母的代谢提供了较为有利的环境。此外，糖化产物中的葡萄糖和木糖浓度显著增加，进一步提高了乙醇的产量。研究还发现，该酶组合在高固含量条件下的表现优于其他类似研究，如Kovács等在蒸汽预处理木屑中使用*Trichoderma atroviride*的酶组合，仅获得4.9 g/L的葡萄糖浓度，而本研究中的糖化产物在35%固含量条件下达到了更高的还原糖浓度，这可能与SSF工艺的高效性以及表面活性剂的辅助作用有关。

本研究还对糖化过程中可能产生的抑制物进行了分析，发现碱处理后的玉米芯在糖化过程中几乎没有检测到FF和HMF，而乙酸和甲酸的浓度也保持在较低水平。这种抑制物的减少可能是由于表面活性剂的作用，其能够减少非生产性酶吸附，提高酶的催化效率，同时降低抑制物的生成。这为后续的酒精发酵提供了良好的基础，使酵母能够更有效地将糖转化为乙醇。此外，该研究还强调了SSF工艺在生产（hemi）纤维素降解酶方面的优势，不仅能够减少对昂贵培养基的依赖，还能提高酶的产量和活性，从而降低整个生物转化过程的成本。

综上所述，本研究通过SSF工艺生产了一种高效且低成本的酶组合，能够显著提高碱处理后的玉米芯和秸秆的糖化效率，并结合分批补料模式和表面活性剂的使用，进一步优化了整个生物转化过程。这些成果不仅为第二代乙醇的生产提供了新的思路，也为木质纤维素生物精炼厂的可持续发展提供了可行的方案。此外，研究还指出，不同底物、菌株和培养条件对酶的表达具有重要影响，因此在实际应用中，需要根据具体情况进行优化。未来的研究可以进一步探索其他微生物在酶生产中的潜力，以及如何通过调整培养条件和底物种类，提高酶的产量和活性，从而推动生物燃料技术的进一步发展。