在[FeFe]-氢化酶中改进电子中继机制可提升H2的电催化生成效率

《ACS Catalysis》：Engineering the Electron Relay in [FeFe]-Hydrogenase Enhances Electrocatalytic H2 Evolution

氢化酶工程与F域截断效应研究。通过系统截断Clostridium acetobutylicum M3型[FeFe]-氢化酶CaHydA1的F域，获得三个变体（S75、D127、S208），电化学测试显示其H2氧化还原电流密度与野生型相当，但H2生产偏好性增强，O2敏感性显著降低。光谱分析表明截断后FeS簇电子环境改变，但H簇局部结构保持稳定。研究证实F域主要影响酶与电极相互作用及红ox伴侣结合，而非直接调控O2抗性或催化过电位。变体S208产率提升5.6倍，为生物催化应用提供新思路。

　　氢气（H?）作为一种清洁的能源载体，因其在化学反应中的高效性和环境友好性而备受关注。然而，目前实现氢气清洁生产的方法中，催化剂的效率和成本仍然是主要的挑战。[FeFe]-氢化酶作为自然界中最活跃的氢气转化催化剂，因其独特的有机金属活性中心和由蛋白质矩阵精细调控的特性而成为研究的重点。这些酶能够催化氢气与质子和电子之间的相互转化反应（H? ? 2H? + 2e?），并且在常温常压下表现出非常高的反应速率，同时对过电位的要求极低。因此，[FeFe]-氢化酶在绿色氢气生产方面具有巨大的应用潜力。

在[FeFe]-氢化酶中，H簇是其独特的活性位点，它由一个典型的[4Fe–4S]簇和一个包含开放配位位点的二铁亚簇组成。H簇中还包含一个氮桥连接的氮杂二硫代乙酸盐（ADT）基团，该基团在催化过程中可能作为质子供体或受体，从而影响氢气的生成或氧化。此外，[FeFe]-氢化酶还包含多个铁硫簇（FeS），这些簇不仅在分子内部促进电子转移，还在分子间与红ox伴侣进行电子传递。不同类型的[FeFe]-氢化酶在结构和功能上存在显著差异，例如M1型仅包含H域，而M3型则包含两个额外的F域，其中包含不同的铁硫簇，如FS4C和FS2。M3型[FeFe]-氢化酶在氧气耐受性方面表现突出，这使得它们成为生物技术研究的重要目标。

为了深入研究F域在[FeFe]-氢化酶中的具体作用，本研究系统地对来自Clostridium acetobutylicum的[FeFe]-氢化酶（CaHydA1）进行了F域的逐步截断，生成了三种不同的截断蛋白。这些截断蛋白不仅在功能上保持了与天然酶相似的高催化活性，而且在结构上也表现出显著的简化，使其更易于生产和纯化。研究结果表明，截断后的蛋白在电催化性能上优于天然酶，且在无过电位的情况下表现出良好的双向催化能力。这一发现对于开发高效、低成本的氢气生产催化剂具有重要意义。

进一步的实验表明，截断后的CaHydA1蛋白在氧气抑制和一氧化碳（CO）抑制方面表现出不同的反应特性。与天然酶相比，截断蛋白在氧气存在下的电流恢复能力较差，这表明F域可能在氧气耐受性中起到重要作用。具体而言，F域可能通过提供足够的电子来减少氧气，从而避免活性位点产生反应性氧物种（ROS）。然而，对于CO的抑制，截断蛋白与天然酶表现出相似的可逆性，这表明F域的去除并未显著改变酶的气体通道结构。

此外，研究还通过溶液活性实验探讨了截断蛋白与人工和生理红ox伴侣之间的相互作用。结果显示，截断后的CaHydA1蛋白在使用人工红ox伴侣（如甲基紫精）时表现出更高的催化活性，但在使用天然红ox伴侣（如CaFd）时则显示出显著的活性下降。这一现象支持了F域中的[2Fe–2S]簇可能是CaFd的结合位点，因为当该簇被移除后，截断蛋白无法与CaFd有效结合，从而导致催化活性的丧失。这为理解[FeFe]-氢化酶的电子传递机制提供了新的视角。

为了进一步验证这些发现，研究还采用了红外（IR）光谱和电子顺磁共振（EPR）光谱技术对H簇的电子环境和结构特性进行了分析。IR光谱结果显示，截断蛋白的H簇电子环境与天然酶存在细微差异，这可能与F域中铁硫簇的远程影响有关。而EPR光谱则揭示了H簇在不同氧化状态下的磁性特征，表明截断蛋白在H簇的几何结构和电子耦合方面与天然酶保持一致，但其氧化状态下的信号特征有所不同。这些结果进一步支持了F域在调控H簇电子行为中的关键作用。

本研究通过系统截断CaHydA1的F域，不仅揭示了不同F域在催化性能、氧气耐受性和电子传递中的具体贡献，还为设计和优化人工氢化酶提供了理论依据。研究发现，截断后的蛋白在电催化性能上表现出更高的效率，这可能与其更小的尺寸和更优的表面电荷分布有关。同时，截断蛋白在氧气耐受性方面也表现出显著的增强，这表明H簇的活性位点可能具有更强的抗氧能力，而F域则可能通过提供额外的电子来增强这种能力。

总的来说，这项研究为理解[FeFe]-氢化酶的结构-功能关系提供了重要的实验依据。通过逐步截断F域，研究团队成功获得了具有高催化活性和良好氧气耐受性的酶变体，这些变体在生物技术应用中展现出巨大的潜力。此外，研究还揭示了F域在调控催化偏倚和电子传递中的关键作用，为未来的氢气生产催化剂设计提供了新的思路。未来的研究可以进一步探索如何通过调整F域的结构和组成来优化氢化酶的性能，从而推动绿色能源技术的发展。