促炎性小胶质细胞的温磁诱导：一种基于脂质的纳米载体策略用于胶质母细胞瘤免疫治疗

《ACS Applied Materials & Interfaces》：Thermo-Magnetic Induction of Pro-Inflammatory Microglia: A Lipid-Based Nanovector Strategy for Glioblastoma Immunotherapy

研究提出利用脂基磁纳米向量（LMNVs）结合交变磁场（AMF）刺激诱导小胶质细胞M1样极化，释放IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子，并通过免疫原性细胞死亡（ICD）显著抑制胶质母细胞瘤（GBM）细胞增殖与存活。纳米粒子在生物相容性、高效内吞（主要定位于溶酶体）及磁热转化特性方面表现优异，且ICD标志物（如HMGB1核外转位和CRT胞外暴露）验证了其免疫治疗效果。该策略为远程可控的脑肿瘤免疫治疗提供了新方案。

　　在中枢神经系统（CNS）中，小胶质细胞作为主要的免疫细胞，不仅在维持生理稳态中发挥关键作用，还在应对病理变化时展现出重要的功能。这些细胞能够通过吞噬和清除病理性蛋白聚集体，发挥保护神经的作用，但过度的吞噬行为可能导致其自身功能受损，进而引发神经炎症和神经退行性病变。由于其免疫功能，小胶质细胞广泛存在于CNS的各种疾病中，包括恶性脑肿瘤。在胶质瘤中，小胶质细胞和巨噬细胞（GAMs）构成了最大的免疫浸润细胞群体，占据了肿瘤质量的约40%。它们与胶质瘤细胞的相互作用促使了一种复杂的动态激活状态，主要表现为免疫抑制（M2样）反应，而M1样（促炎性）反应则相对较少。尽管小胶质细胞具有诱导抗肿瘤反应的潜力，但胶质瘤细胞会通过释放免疫抑制因子来对抗这一效应，从而有效地使小胶质细胞的防御机制失活。同时，小胶质细胞还会分泌一系列免疫调节性细胞因子，这些细胞因子支持肿瘤生长。然而，传统的M1/M2分类模型在描述小胶质细胞的多种激活状态和其在胶质瘤微环境中的功能可塑性方面显得过于简单，未能充分反映其复杂的行为。因此，有必要开发新的命名体系，以更好地描述小胶质细胞在胶质母细胞瘤（GBM）中的异质性和情境依赖性作用。尽管如此，基于传统简化模型的分类方法对于明确小胶质细胞在CNS疾病中的作用及其免疫调节的治疗潜力仍然具有重要价值。

为了对抗GBM，调控小胶质细胞活性，特别是促进其向促炎性M1样表型转化，已成为一种有前景的治疗策略。纳米材料因其能够特异性靶向这些细胞并诱导原位免疫调节的潜力，被认为是调控小胶质细胞反应的有效工具。近年来，研究者探索了多种纳米结构作为免疫调节剂，旨在刺激小胶质细胞向促炎性表型转化，以对抗脑癌。这些策略可以分为三类：主动调控、被动调控和远程激活调控。例如，Wang等人发现，负载多柔比星的氧化锌纳米颗粒（ZnO-DOX）能够诱导巨噬细胞向M1样表型转化，从而促进抗肿瘤反应。该研究表明，ZnO-DOX纳米颗粒能够通过刺激巨噬细胞上调促炎性标记物如CD80和CD86的表达，从而调控肿瘤微环境。类似的促炎性小胶质细胞表型转化效果也观察到了二氧化硅纳米颗粒（SiNPs）和氧化铁纳米颗粒（IONPs）的使用。这些纳米颗粒因其固有的物理化学特性和表面功能化特性，能够直接影响小胶质细胞行为，促进促炎性表型的形成，而无需外部激活或药物负载。此外，带正电的IONPs增强了与小胶质细胞的相互作用，从而诱导促炎性反应，这些反应是M1样表型的特征。基于这些发现，更多的纳米系统被开发出来，以进一步拓展免疫调节的工具箱。除了已报道的ZnO、SiNPs和IONPs，基于聚（β-氨基酯）（PbAE）的聚合物纳米载体也被设计用于同时递送编码干扰素调节因子5（IRF5）和IKKβ的mRNA，这两种关键的转录因子对于M1样表型的形成至关重要。在临床前的GBM模型中，这种方法显著增加了M1相关细胞因子的表达，抑制了肿瘤生长，并延长了生存期。另一种创新系统是使用DNA接枝的聚己内酯刷（DNA-g-PCL）纳米结构，结合微小RNA-155，并通过红细胞膜进行免疫逃逸和功能化处理，使其能够选择性地富集在M2样小胶质细胞/巨噬细胞中，并成功地将它们重新编程为M1样表型，从而减少了肿瘤负担。这些研究结果表明，纳米材料在调控小胶质细胞反应方面具有巨大潜力。

近年来，纳米材料在外部刺激（如超声波或磁场）作用下，能够远程调控小胶质细胞向M1样促炎性表型转化的能力得到了显著提升。这种策略可以被视为一种前沿的手段，用于影响小胶质细胞的极化并增强抗肿瘤反应。在这一领域，我们的研究小组先前的一项工作展示了由压电纳米颗粒（PNPs）制成的系统，该系统能够通过外部超声波刺激激活小胶质细胞并促进促炎性细胞因子的释放，从而减少GBM细胞的活性和增殖。尽管超声波激活的压电纳米颗粒具有显著的潜力，但该技术面临诸多挑战。其中最显著的问题是超声波穿透深度的限制。虽然超声波具有非侵入性，但往往难以有效穿透到较深的脑组织，尤其是当肿瘤位于大脑深处或被密集的组织结构（如骨骼或液体）包围时。这种穿透深度的不足可能会限制超声波相关治疗的效果，使其在治疗深部肿瘤时效果不佳。此外，超声波刺激的精确性和控制性对于确保纳米颗粒的靶向激活至关重要。由于不同患者的组织成分或头骨结构存在差异，超声波波的传播可能会受到影响，从而导致不一致或次优的治疗结果。鉴于这些局限性，探索其他外部刺激方式，如磁场，可能为远程激活调控提供更有效和可靠的方法。磁性纳米颗粒（MNPs）能够对磁场做出反应，使在深部脑区的靶向和激活成为可能。与超声波相比，磁场可以更均匀地穿透组织，并提供对颗粒运动和激活更精细的控制，为改善脑癌治疗中远程激活疗法的疗效提供了新的思路。

在本研究中，我们提出了一种新的方法，利用磁性纳米颗粒（MNPs）诱导抗肿瘤的小胶质细胞反应。本研究旨在结合交替磁场（AMF）刺激与嵌入脂质基质中的氧化铁纳米颗粒（IONPs），以构建脂质基质磁性纳米载体（LMNVs）。设计的LMNVs在人类小胶质细胞（HMC3细胞）中表现出优异的生物相容性和高效的细胞内化能力。在AMF刺激下，LMNVs触发了小胶质细胞中细胞内钙离子浓度的持续增加，进而促使小胶质细胞向促炎性M1样表型极化。这种激活现象通过关键促炎性标记物（CD40、CD86）和细胞因子释放（IL-6、IL-8和TNF-α）的上调得到了验证，这些效应与IFN-γ刺激的结果相似。这些发现进一步通过比较转录组分析得到了支持。值得注意的是，来自LMNVs+AMF处理后的小胶质细胞的条件培养基显著抑制了永生化和患者来源的GBM细胞的活性和增殖，显示出强大的抗肿瘤反应。肿瘤细胞死亡与免疫原性细胞死亡（ICD）相关，这一点通过损伤相关分子模式（DAMPs）的转移得到了证实，特别是高迁移率组盒蛋白1（HMGB1）和钙网蛋白（CRT）。总体而言，这些结果突显了LMNVs作为远程可激活的纳米平台的潜力，该平台能够重新编程小胶质细胞并促进GBM的抗肿瘤免疫反应。

为了更深入地理解LMNVs和AMF对小胶质细胞的影响，我们进行了转录组分析。具体而言，我们分析了四个实验组之间的基因表达差异：AMF vs CTRL、LMNVs vs CTRL、LMNVs+AMF vs CTRL以及IFN-γ vs CTRL。通过这些比较，我们识别了显著上调和下调的基因，如表中所示。数据的分析（火山图如图6所示）揭示了共同和条件特异性转录机制，这些机制能够解释小胶质细胞的稳态维持以及M1样表型的诱导。值得注意的是，我们发现了一组主要的共同调控基因：一组在AMF和LMNVs组中共同表达，主要反映了稳态调控；另一组则在IFN-γ和LMNVs+AMF组中共同表达，这些基因与促炎性和免疫原性通路相关。在所有实验组中，TNF和NFKBIA的上调并不一定意味着炎症，因为小胶质细胞中的基础TNF表达是一种生理机制，有助于突触可塑性和神经元功能的调节。同样，NFKBIA编码IκBα，这是NF-κB的典型负反馈调节因子，其上调反映了NF-κB活性的平衡状态，即其活性被抑制机制所抵消。因此，TNF和NFKBIA的共同上调表明了一种基础的准备状态，这种状态在所有实验条件下都受到ITGB8和RCAN1的调控。

在IFN-γ处理的小胶质细胞和LMNVs+AMF处理的小胶质细胞中，这一平衡被打破。这些实验组中，CD14、SOX9、HMGCS1/HMGCR、TRPM2和KCNN1的上调与小胶质细胞的促炎性激活密切相关。CD14作为TLR4的核心受体，增强了小胶质细胞对促炎性信号的敏感性，并放大了NF-κB介导的促炎性细胞因子的转录。CD14的上调通常标志着小胶质细胞处于促炎性状态，并增强了TNF、IL-6和IL-1β等细胞因子的产生。Reed-Geaghan等人在体内的研究显示，缺乏CD14的小胶质细胞表现出与M1样小胶质细胞相似的促炎性反应减弱。SOX9通常与星形胶质细胞分化相关，但也有研究将其与促炎性胶质反应联系起来，可能反映了星形胶质细胞和小胶质细胞在神经炎症中的相互作用。HMGCS1和HMGCR虽然主要参与胆固醇合成，但也驱动了代谢重编程，增强了先天免疫训练，并促进了NF-κB和TLR信号传导，这些过程在使用他汀类药物的巨噬细胞和小胶质细胞中受到抑制。TRPM2和KCNN1的上调提供了关于LMNVs辅助的磁热刺激后细胞内钙离子动态的深入见解。TRPM2是一种钙离子通透性非选择性阳离子通道，能够感知氧化应激和热刺激，直接与TNF和IL-6的释放相关，并且其活动有助于病理炎症的发生。KCNN1编码由钙离子/钙调素激活的小电导钙离子通道SK1，这些通道在钙离子进入时促进膜超极化，从而进一步通过TRPM2和其他通道增加钙离子的进入。这形成了一个正反馈回路，维持钙离子信号传导，这对于保持M1样极化至关重要。

尽管AMF刺激在某些情况下可能不会显著改变细胞的活性，但其与LMNVs的结合能够显著改变小胶质细胞的表型。在慢性AMF刺激下，小胶质细胞表现出形态学变化，如细胞形态的延长，这通过共聚焦显微镜图像（图4）得到了验证。圆度（图4b）和纵横比（图4c）的定量分析显示，LMNVs+AMF组和IFN-γ组的圆度显著降低，纵横比显著增加。这些变化表明小胶质细胞在AMF刺激下经历了形态和功能上的重塑，这一过程可能与细胞骨架相关基因（如FN1和DBN1）的表达变化有关。FN1作为细胞外基质的关键成分，增强了小胶质细胞的粘附、吞噬活性和细胞骨架重组，这些特性与细胞形态的延长和激活状态密切相关。DBN作为一种细胞骨架结合蛋白，通过改变纤维架构，将细胞骨架与微管连接，从而支持细胞形态的延长。

此外，我们还通过qRT-PCR分析了小胶质细胞在不同处理条件下的基因表达，包括IL-6、IL-8和TNF-α的转录水平。这些促炎性细胞因子的mRNA表达在所有实验条件下都得到了评估。结果表明，单独的AMF或LMNVs处理并未显著改变这些细胞因子的转录水平，但LMNVs+AMF处理显著增加了IL-6和IL-8的转录，分别增加了2.5±0.2倍和3.2±0.2倍，这些水平与IFN-γ处理后的结果相似。TNF-α的转录增加幅度稍低，但总体趋势一致。为了进一步验证这些转录数据在蛋白质水平上的表现，我们进行了ELISA分析，以评估这些细胞因子在培养上清中的分泌情况。结果显示，ELISA结果与qRT-PCR结果的趋势一致，表明LMNVs+AMF处理能够有效驱动小胶质细胞的激活，这为小胶质细胞在GBM中的抗肿瘤反应提供了有力的证据。

在评估LMNVs和AMF对GBM细胞的影响时，我们观察到，经过LMNVs+AMF处理的小胶质细胞的条件培养基对永生化GBM细胞（U87-MG）和患者来源的GBM细胞均产生了显著的细胞毒性作用。LIVE/DEAD和PicoGreen检测显示，患者来源的GBM细胞在暴露于小胶质细胞条件培养基后，其细胞活力和增殖能力显著下降。此外，代谢活性的减少也进一步支持了这些细胞的活性受到抑制。通过免疫染色分析，我们还观察到患者来源的GBM细胞中K_i-67的表达显著降低，表明细胞增殖受到抑制。在这些实验组中，HMGB1和CRT的表达也显著增加，这表明GBM细胞可能经历了免疫原性细胞死亡（ICD）。CRT的外化是ICD的早期标志，有助于抗原呈递细胞识别和吞噬肿瘤细胞，而HMGB1的释放则进一步成熟树突状细胞，通过与Toll样受体（TLR）的相互作用增强免疫反应。在LMNVs+AMF处理的GBM细胞中，观察到的HMGB1转移和CRT的胞质积累进一步支持了免疫原性细胞死亡的发生。这种模式与IFN-γ处理的正向对照相似，加强了ICD诱导的证据。

综上所述，LMNVs作为一种新型的磁性纳米材料，其在AMF刺激下能够有效诱导小胶质细胞向促炎性表型转变，并对GBM细胞产生显著的抗肿瘤作用。这些发现不仅揭示了纳米材料在免疫调控中的潜力，还为开发新的免疫治疗策略提供了理论依据。未来的研究可以进一步探索该策略在体内的应用，特别是在肿瘤模型中评估其治疗效果。此外，由于GBM的高度异质性，未来的实验还应考虑采用更具体的策略，如表面功能化以增强对患者来源小胶质细胞的靶向识别。这些策略可能包括使用患者来源的免疫相关蛋白，以提高靶向特异性和血脑屏障（BBB）穿透能力，这对CNS治疗是一个重要的挑战。尽管本研究未直接评估这一方面，但我们的先前工作表明，LMNVs能够在动态的体外BBB模型中穿过血脑屏障，这表明该平台具有内在的穿越能力，而表面功能化策略可以进一步增强这一特性。在GBM的病理背景下，血脑屏障常常在肿瘤核心和周围区域出现结构破坏，这可能进一步促进LMNVs的富集。此外，我们的实验还显示，未涂层和涂层的纳米载体均表现出一定的BBB穿透能力，尽管涂层的纳米载体显示出更高的转运效率。这些结果为未来开发更有效的纳米平台提供了重要线索。

在本研究中，我们还评估了AMF刺激对小胶质细胞的生理影响，确保其在治疗应用中的安全性。虽然AMF刺激可能需要专门的仪器和精确的场强校准以避免意外的热效应，但AMF相关的磁热疗法已在胶质母细胞瘤和其他实体瘤的临床研究中得到了广泛验证。这些研究确认了该方法在已知生物物理限制内的可行性和安全性。值得注意的是，这种对AMF的依赖也可以被视为一种优势：它允许远程、非侵入性且空间限定的LMNVs激活，从而减少全身暴露并限制治疗效果仅限于纳米颗粒聚集的部位。随着磁热治疗设备设计的持续改进，如图像引导的靶向和微型化系统，这种策略的转化潜力和临床可操作性有望进一步提升。

最后，我们的研究结果表明，通过LMNVs+AMF的慢性刺激诱导小胶质细胞向抗肿瘤表型转变，是一种具有巨大前景的治疗策略。这一方法不仅能够有效调控小胶质细胞的行为，还能够通过激活免疫原性细胞死亡机制，显著降低GBM细胞的活性和增殖能力。这些发现不仅为GBM的免疫治疗提供了新的思路，也为纳米材料在免疫调控中的应用开辟了新的方向。未来的实验应考虑更复杂的模型，如类器官或器官芯片系统，以整合血管和肿瘤成分，从而进一步验证该策略的疗效，并为体内的预临床研究奠定基础。