基于茶皂素的Zanthoxylum bungeanum精油纳米乳液对牛乳腺炎病原体的抗炎、抗氧化和抗菌作用

《Industrial Crops and Products》：Anti-inflammatory, antioxidant, and antibacterial activity of tea saponin-based Zanthoxylum bungeanum essential oil nanoemulsions against bovine mastitis pathogens

茶皂素稳定纳米乳液（ZEO-NE）通过超临界流体萃取制备，其主成分为月桂烯（24.83%）、月桂烯乙酸酯（16.08%）和柠檬烯（14.02%）。ZEO-NE表现出优异的物理稳定性（30天储存稳定，4-50℃温度耐受，离心稳定性达6000rpm），且较游离ZEO具有更强的自由基清除能力（DPPH、ABTS、OH-自由基清除率提高30%-50%），对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和乳酸链球菌的抑菌圈直径增加4.29-3.27mm，MIC降低50%-75%。机制研究表明其通过破坏细菌细胞膜（电导率提升70%，核酸外漏量增加2.3倍）和调节宿主炎症因子（TNF-α、IL-1β表达量降低60%-80%）发挥作用。

　　本研究围绕从中国武都地区提取的花椒精油（ZEO）展开，旨在通过开发一种茶皂苷（TS）稳定型纳米乳液（ZEO-NE），提高其在实际应用中的适用性。ZEO作为一种天然植物提取物，因其抗菌、抗炎和杀虫等特性，在食品和制药领域具有重要价值。然而，由于其高挥发性、低水溶性和强气味，ZEO在实际应用中存在一定的局限性。因此，通过纳米封装技术，将ZEO封装为纳米乳液，不仅能够改善其物理特性，还能提升其生物活性。研究重点分析了ZEO-NE的组成、物理性能、稳定性以及生物活性，并对其抗菌机制、抗氧化能力及抗炎作用进行了系统评估。

### 1. 研究背景与意义

牛奶作为一种营养丰富的食品，受到全球消费者的广泛欢迎。然而，奶牛乳腺炎的高发率一直是影响牛奶质量和奶业经济效益的重要问题。乳腺炎通常由细菌感染引起，特别是在奶牛免疫系统受损的情况下，这种感染会引发乳腺组织的严重损伤。根据现有研究，乳腺炎在欧盟每年每头奶牛的经济损失超过185欧元，而全球范围内则高达350亿美元。此外，研究表明，奶牛在泌乳期和泌乳初期的氧化应激可能增加其对乳腺炎及其他代谢疾病的易感性。尽管抗生素仍是治疗乳腺炎的主要手段，但其耐药性的上升使得治疗变得复杂，不仅增加了治疗时间，还可能导致治疗失败以及牛奶残留问题。因此，寻找替代抗生素的天然抗菌剂成为全球研究的重点。

植物精油因其天然来源和广泛的生物活性，受到了越来越多的关注。它们的抗菌作用主要源于其中的生物活性成分，如单萜类、倍半萜类和酚类化合物。此外，精油还具有抗氧化、免疫调节和抗炎等多种功能，这为其在食品保鲜、医药和农业领域的应用提供了广阔前景。其中，花椒精油因其显著的抗菌、抗炎和杀虫活性，被广泛应用于食品和医药行业。然而，其高挥发性、低水溶性和强气味限制了其在实际应用中的性能表现。为了解决这些问题，研究者们尝试通过纳米封装技术，将花椒精油转化为纳米乳液，以提高其稳定性、水溶性和生物活性。

### 2. 研究方法与技术路线

本研究采用茶皂苷作为天然表面活性剂，通过超声波辅助乳化技术，将花椒精油封装为稳定的纳米乳液。整个实验过程包括以下几个关键步骤：

#### 2.1 花椒精油的提取

花椒精油是从中国甘肃省武都地区的花椒果实外皮中提取的。提取过程采用水蒸气蒸馏法，在2小时内完成。所得精油经过无水硫酸钠脱水后，储存于密封的琥珀色玻璃瓶中，以确保其稳定性。研究中还对比了不同提取条件对精油产量的影响，发现通过优化提取参数，可以显著提高精油的提取效率。

#### 2.2 抗菌活性评估

通过抑菌圈法（DIZ）和最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）测试，评估了ZEO和ZEO-NE对三种主要乳腺炎病原菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和溶血性链球菌）的抗菌效果。结果显示，ZEO-NE在抗菌能力方面优于未封装的ZEO，这可能与纳米封装增强了精油与细菌细胞膜的相互作用有关。

#### 2.3 抗氧化活性分析

通过DPPH自由基清除、ABTS自由基清除和羟基自由基清除实验，评估了ZEO和ZEO-NE的抗氧化能力。结果显示，ZEO-NE在抗氧化性能方面优于ZEO，这可能与其纳米结构提高了精油成分与自由基的接触面积和反应效率有关。

#### 2.4 抗炎作用研究

通过检测BMECs（牛乳腺上皮细胞）中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达水平，评估了ZEO和ZEO-NE的抗炎效果。结果显示，ZEO-NE在降低促炎因子表达方面表现出更好的效果，这可能与其能够更有效地穿透细胞膜并发挥抗炎作用有关。

#### 2.5 稳定性分析

ZEO-NE的稳定性评估包括储存稳定性、热稳定性和离心稳定性。研究发现，ZEO-NE在4°C储存30天内保持稳定，但在60天后出现分层现象，表明其在长期储存中可能存在一定的物理不稳定。此外，ZEO-NE在加热至50°C以下保持稳定，而超过此温度则会导致粒子尺寸增加和电位降低，这提示其在高温环境下需要特别注意。离心实验显示，ZEO-NE在8000 rpm以下保持稳定，但超过此速度时，其稳定性下降，这表明其在运输和使用过程中应避免剧烈机械力。

#### 2.6 抗菌机制研究

通过测量细菌培养液的电导率、细胞外核酸泄漏、碱性磷酸酶（AKPase）活性和蛋白质泄漏等指标，研究了ZEO和ZEO-NE对细菌细胞膜的破坏作用。结果显示，ZEO-NE能够显著提高细菌膜的通透性，导致细胞外核酸和蛋白质的泄漏，以及AKPase的释放，表明其对细菌细胞膜具有破坏作用。这些结果进一步验证了ZEO-NE的抗菌机制，即通过破坏细菌细胞膜，使其失去细胞完整性，从而实现抗菌效果。

### 3. 实验结果与讨论

#### 3.1 精油产量与成分分析

本研究首次采用茶皂苷作为稳定剂，成功制备了ZEO-NE。在提取过程中，通过优化参数，获得的花椒精油产量达到5.65%，比传统蒸汽蒸馏法提高了94.8%。这一显著提升可能与提取条件的优化有关，例如加热温度、时间以及原料的处理方式。此外，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，确定了ZEO的主要成分，包括芳樟醇（24.833%）、芳樟醇乙酸酯（16.076%）和d-柠檬烯（14.019%），这些成分在精油中占比高达54.928%。研究还发现，不同地区花椒精油的化学组成存在差异，这可能与地理位置、灌溉水质、生长阶段和干燥方法等因素有关。

#### 3.2 ZEO-NE的物理特性

ZEO-NE的平均粒径为188.49±6.15 nm，聚散指数（PDI）为0.17±0.04，电位为-26.02±0.47 mV。这些数据表明，ZEO-NE具有良好的分散性和稳定性。与传统的合成表面活性剂相比，茶皂苷作为天然表面活性剂，不仅提供了良好的乳化性能，还具有良好的生物相容性和环境友好性。研究还发现，ZEO-NE表现出非牛顿流体特性，其粘度随剪切速率的增加而降低，显示出剪切稀化行为，这表明其具有良好的流动性和适配性。

#### 3.3 ZEO-NE的稳定性

ZEO-NE在4°C下储存30天后保持稳定，但60天后出现分层现象，表明其在长期储存中存在一定的物理不稳定。热稳定性实验显示，ZEO-NE在低于50°C的条件下保持稳定，但在高温下，其粒径增大，电位降低，这可能是由于热力学不稳定导致的乳滴聚结现象。离心实验进一步证实了这一点，表明ZEO-NE在8000 rpm以下保持稳定，但超过此速度时，其稳定性下降。这些结果提示，ZEO-NE在储存和使用过程中应避免高温和剧烈机械力，以维持其性能。

#### 3.4 抗菌活性分析

ZEO-NE在抗菌活性方面表现出显著优势。通过抑菌圈法（DIZ）和最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）测试，发现ZEO-NE的抑菌圈直径比未封装的ZEO更大，且MIC和MBC值更低，表明其抗菌效果更佳。此外，ZEO-NE在抑制细菌生长方面表现出浓度依赖性，且在2 MIC浓度下，能够完全抑制三种病原菌的生长。这可能是由于纳米封装提高了精油成分与细菌细胞膜的接触面积，从而增强了其抗菌能力。

#### 3.5 抗氧化活性评估

ZEO-NE在抗氧化活性方面也表现出显著提升。通过DPPH、ABTS和羟基自由基清除实验，发现ZEO-NE的清除能力优于ZEO。这可能与其纳米结构增加了精油成分与自由基的接触面积有关。此外，ZEO-NE的清除效率随浓度的增加而提高，表明其具有良好的浓度依赖性。这些结果表明，ZEO-NE在食品保鲜和抗菌应用中具有重要的潜力。

#### 3.6 抗炎作用研究

ZEO-NE在抗炎作用方面同样表现出显著优势。通过检测BMECs中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达水平，发现ZEO-NE能够显著降低这些因子的表达，从而减轻炎症反应。此外，ZEO-NE在降低细胞毒性方面也优于未封装的ZEO，这可能与其缓慢释放机制有关。这些结果表明，ZEO-NE在抗炎应用中具有良好的前景。

### 4. 结论

本研究成功开发了一种茶皂苷稳定型花椒精油纳米乳液（ZEO-NE），并对其物理特性、稳定性、抗菌活性、抗氧化能力和抗炎作用进行了系统评估。研究发现，ZEO-NE在抗菌、抗氧化和抗炎方面均优于未封装的ZEO，这可能是由于纳米封装提高了精油成分与目标物质的接触面积和反应效率。此外，ZEO-NE表现出良好的储存稳定性、热稳定性和离心稳定性，表明其在实际应用中具有一定的适应性。然而，其在60天后出现分层现象，提示需要进一步优化配方以提高其长期稳定性。总的来说，ZEO-NE作为天然抗菌剂和抗氧化剂，在食品保鲜和治疗奶牛乳腺炎方面展现出广阔的前景。未来的研究可以进一步探索其在不同应用场景中的适应性，并优化其配方以提高其稳定性和有效性。