WNT5A介导的蛋白质组学和磷酸蛋白质组学调控网络在类风湿性关节炎中的作用

《In Analysis》：The Role of WNT5A-mediated proteomic and phosphoproteomic regulatory networks in rheumatoid arthritis

本研究通过整合蛋白质组和磷酸蛋白质组学分析，探讨WNT5A信号通路在RA-FLS中的作用，发现WNT5A通过调控AMPK、mTOR、Notch等通路影响FLS的增殖、炎症反应及细胞骨架重塑，为RA治疗提供新靶点。

　　本研究围绕类风湿性关节炎（RA）中一种关键的信号通路——WNT5A信号通路，探讨其在RA相关成纤维细胞样滑膜细胞（RA-FLS）中的作用机制。研究通过整合蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析，系统揭示了WNT5A如何通过调控蛋白质表达及磷酸化修饰影响细胞功能和信号传导。这一研究不仅为理解RA的病理机制提供了新的视角，也为未来开发针对性治疗策略奠定了基础。

类风湿性关节炎是一种慢性、系统性的自身免疫性疾病，主要表现为对称性多关节炎，并伴随关节疼痛、肿胀和功能障碍。随着疾病的发展，RA不仅对关节造成损害，还可能影响心血管、呼吸系统和神经系统，严重影响患者的生活质量。RA的发病率在全球范围内估计在0.5%到1%之间，女性发病率高于男性，给社会和经济带来了显著负担。RA的发病机制复杂，涉及多种细胞类型之间的相互作用，其中成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）在RA的病理过程中起着关键作用。这些细胞不仅在炎症反应中表现出异常的增殖和侵袭性，还过度分泌炎性介质，加剧关节炎症状并导致不可逆的软骨和骨质破坏。

WNT5A是Wnt信号通路中的一个非经典配体，其在RA中的作用逐渐受到关注。Wnt信号通路是调控细胞增殖、分化、迁移和存活的重要细胞间通讯系统，可分为经典（β-连环蛋白依赖性）和非经典（β-连环蛋白独立性）两种模式。在RA的病理环境中，非经典Wnt信号蛋白，特别是WNT5A，表现出异常激活。已有研究表明，WNT5A通过与受体结合，促进FLS的增殖和迁移，并诱导促炎性细胞因子的表达，从而加剧关节破坏。此外，一些实验发现，RA-FLS在培养过程中会表现出比正常FLS更高的IL-6和IL-8水平，而这些细胞因子的表达模式也可以通过将正常FLS转染WNT5A表达载体来复制。因此，WNT5A的异常表达及其信号通路的激活被认为是RA中滑膜炎和组织破坏的关键因素之一。基于这些发现，针对WNT5A信号通路的干预可能为RA提供新的治疗方向。

本研究采用了一种综合性的分析方法，即通过TMT标记的定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学技术，结合激酶-底物调控网络重建和KSEA预测，系统性地解析WNT5A对RA-FLS的调控机制。这种策略的优势在于，它能够同时捕捉蛋白质表达和磷酸化修饰的动态信息，并识别关键的激酶节点及其潜在底物，从而提出可进一步验证的候选分子和通路。研究对象为MH7A细胞，这是一种从RA患者滑膜组织中分离得到的成纤维细胞样细胞，具有贴壁生长的特点，可以在体外持续传代，形成稳定的细胞系。通过将MH7A细胞暴露于重组WNT5A蛋白（rhWNT5A）中，研究者能够模拟RA病理条件下的WNT5A信号激活，并分析其对细胞功能的影响。

在实验设计中，细胞模型的构建遵循标准流程。首先，将MH7A细胞接种于6孔板中，每孔细胞密度为5×10^4个，并在37°C、5% CO?的培养箱中培养24小时。随后，将细胞分为两组：对照组和rhWNT5A处理组。对照组细胞在无任何处理的情况下继续培养24小时，而rhWNT5A处理组则在培养液中加入100 ng/mL的rhWNT5A，并在相同条件下培养24小时。为了确保实验的可靠性，细胞在培养过程中定期进行形态观察，以评估其生长状态和变化情况。

在样本收集阶段，研究者使用预冷的PBS溶液对细胞进行温和洗涤，去除培养液后，利用无菌细胞刮刀将细胞刮下并转移至离心管中。细胞随后在4°C下以1500 rpm的速度离心10分钟，收集细胞沉淀，并迅速冷冻于液氮中，以保持蛋白质的完整性。最终，将细胞沉淀储存于-80°C，等待进一步的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。所有体外实验均采用至少三个生物学重复，以确保结果的可靠性和可重复性。对于每个生物学重复，细胞均独立培养，并单独制备和分析样本。在进行质谱分析之前，如果需要，还会对每个样本进行两次技术重复，以提高数据的准确性。

蛋白质组学分析采用了TMT标记的定量技术，该技术能够同时标记多个样本中的蛋白质，便于后续的比较分析。蛋白质提取过程使用RIPA裂解缓冲液，其中加入了蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以防止蛋白质降解和去磷酸化。提取后的蛋白质浓度通过BCA试剂盒测定，随后进行SDS-PAGE电泳分离，并用胰蛋白酶消化生成肽段。这些肽段被TMT试剂标记后，通过高pH反相液相色谱（HPLC）进行分离，并在高分辨率质谱仪（Q Exactive HF）上进行定量和定性分析。质谱数据使用Proteome Discoverer或MaxQuant软件进行处理，并与人类UniProt数据库进行比对，以确定蛋白质的种类和表达水平。为了提高分析的准确性，所有数据均以至少三个生物学重复为基础，并控制肽段鉴定的假发现率（FDR）在1%以下。

磷酸化蛋白质组学分析与蛋白质组学分析相似，但增加了对磷酸化修饰的检测。在蛋白质提取、分离和消化之后，研究者使用IMAC（免疫亲和色谱）技术对磷酸化肽段进行富集，以提高检测的灵敏度。富集后的磷酸化肽段同样被TMT试剂标记，并通过HPLC进行分离，随后在高分辨率质谱仪上进行定量分析。质谱数据使用MaxQuant软件处理，并与人类UniProt数据库比对，以识别磷酸化修饰的位点和相关蛋白质。为了进一步揭示磷酸化修饰对细胞功能的影响，研究者对显著变化的磷酸化位点进行了功能分析，包括GO、KEGG、InterPro和Reactome数据库的富集分析，以及热图聚类、基序分析和表达模式分析等。这些分析方法有助于揭示磷酸化修饰在RA病理中的潜在作用，如细胞周期调控、能量代谢和炎症反应等。

通过整合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学的数据，研究者发现许多蛋白质在WNT5A干预下同时表现出表达和磷酸化水平的变化。例如，HMGN4、JUN、NPM1、EEF2K和PRKRA等蛋白质被鉴定为显著共表达的分子，它们可能直接或间接参与WNT5A介导的炎症反应、细胞骨架重组等信号通路。PPI网络分析进一步揭示了这些蛋白质之间的复杂调控关系，显示了一些核心蛋白质（如HNRNPA1、NPM1和EEF2K）在调控RNA加工、基因表达和细胞周期方面起着关键作用。HNRNPA1作为一种经典的RNA结合蛋白，参与mRNA的剪接和运输，其磷酸化或上调可能改变炎性基因的剪接模式，从而影响促炎性细胞因子（如IL-6和IL-8）的表达水平，进而促进细胞迁移。NPM1（核磷蛋白）在核糖体组装、DNA修复和细胞周期调控中发挥重要作用，其特定位点的磷酸化变化可能反映核质运输和翻译调控的重编程，从而支持FLS的异常增殖状态。EEF2K（eEF2激酶）作为翻译延伸的关键调控因子，其表达和磷酸化水平的变化可能表明WNT5A通过调控翻译速率与能量代谢之间的关系，影响细胞的存活和应激反应。

此外，研究者还对激酶活性进行了分析，发现CDK1（细胞周期依赖性激酶1）的活性在WNT5A干预下发生了显著变化。CDK1在细胞周期的G2/M期转换中起着关键作用，其激活是细胞进入有丝分裂所必需的。CDK1通过磷酸化关键底物（如NPM1）来驱动细胞周期进程，从而促进细胞增殖。已有研究表明，CDK1在RA患者中表达异常升高，通过调控细胞周期促进滑膜细胞的增殖和关节破坏，进而加剧RA的进展。因此，推测WNT5A可能通过影响CDK1及其底物（如NPM1）来调控FLS的增殖动态。研究还发现，WNT5A通过调控AMPK和mTOR信号通路，可能对RA的发病机制产生深远影响。AMPK作为细胞能量传感器，通过激活与能量代谢相关的通路来维持细胞的能量平衡。然而，在RA中，AMPK的活性通常受到抑制，导致代谢异常，从而促进FLS的异常增殖和促炎性细胞因子的释放。mTOR信号通路则在调控细胞生长、增殖和代谢方面起着关键作用，其过度激活与RA中的FLS异常增殖和促炎性细胞因子分泌密切相关。AMPK和mTOR之间存在相互调控关系，AMPK的激活会抑制mTORC1的活性，从而减少细胞生长和代谢，维持细胞稳态。在RA中，AMPK的下调和mTORC1的过度激活往往同时发生，导致FLS异常增殖和炎症反应加剧。WNT5A通过调控这些通路的磷酸化水平，可能抑制AMPK而激活mTOR，从而抑制自噬并促进异常FLS增殖。这种双向调控机制为理解WNT5A在RA中的致病作用提供了新的见解。

除了能量代谢和细胞周期调控，研究还发现WNT5A对RA病理中的其他关键过程（如内质网应激和DNA修复）有显著影响。例如，WNT5A高度富集于“内质网腔”和“内质网中蛋白质加工”通路，这表明WNT5A可能通过调控内质网应激来影响FLS的增殖和促炎性细胞因子的释放。这一发现与先前的研究一致，即RA中异常的FLS增殖与内质网应激信号通路的激活密切相关。此外，WNT5A还可能通过影响血管生成相关因子（如VEGF）的表达，促进RA中的滑膜血管生成。血管生成是RA病理的重要组成部分，为滑膜组织提供营养和氧气，支持其异常增殖和炎症反应。因此，调控WNT5A可能为RA的治疗提供新的策略。

尽管本研究在体外模型中揭示了WNT5A在RA中的关键作用，但其结论仍需在体内模型中进一步验证。目前，研究主要基于MH7A细胞系，而该细胞系无法完全模拟来源于RA患者的原代FLS。因此，未来的研究应考虑使用原代RA-FLS和动物模型，以验证关键分子和磷酸化位点的功能。此外，研究中仅使用了单一剂量（100 ng/mL）和单一处理时间（24小时），这限制了对剂量-反应关系和时间依赖性调控的系统研究。因此，未来的实验应设计剂量梯度和时间梯度实验，以更全面地了解WNT5A对细胞功能的动态影响。

总体而言，本研究通过整合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，揭示了WNT5A在RA-FLS中的关键调控作用。WNT5A不仅通过影响蛋白质表达和磷酸化修饰改变细胞功能，还可能通过调控多种信号通路（如AMPK、mTOR、VEGFA-VEGFR2和Notch）影响RA的发病机制。研究结果为RA的治疗提供了新的思路，即通过调控WNT5A信号通路，干预FLS的异常行为，从而减轻炎症反应和组织破坏。未来的研究应进一步验证这些候选分子和磷酸化位点的功能，并探索其在临床中的应用潜力，以期为RA患者提供更有效的治疗方案。