通过将一步法LAMP–CRISPR/Cas12b技术与侧向流动检测法相结合，实现对单核细胞增生李斯特菌的快速可视化检测

《Food Microbiology》：Rapid and visual detection of Listeria monocytogenes by combining one-pot LAMP–CRISPR/Cas12b with lateral flow assay

单增李斯特菌快速检测新方法：本研究开发了一体化LAMP-CRISPR/Cas12b检测系统，结合LFA实现肉眼可视化结果，检测限达10 CFU/mL（纯菌）和20 CFU/g（猪肉样本），并缩短了富集时间至3-5小时。实验验证显示该方法与标准培养法结果一致，适用于食品现场快速检测。

　　**快速检测沙门氏菌与李斯特菌的新技术：LAMP-CRISPR/Cas12b与LFA的结合**

在全球范围内，食品中的病原体是导致死亡的重要原因之一，其中李斯特菌（*Listeria monocytogenes*）因其对公共健康和食品安全的严重威胁而备受关注。李斯特菌不仅能够引发轻度的胃肠道疾病，如恶心、腹泻和腹痛，还可能在高风险人群中导致严重的侵入性感染，例如败血症、脑膜炎等，其致死率在易感患者中高达20%至30%。由于李斯特菌具有广泛的环境适应性，能够在多种食品中存活并繁殖，包括肉类、奶制品、鱼类、新鲜水果、沙拉和冷冻蔬菜等，因此其污染风险贯穿于食品的生产、加工、运输和储存的各个环节。2018年，南非爆发了全球最大的李斯特菌感染事件，涉及937例病例和193例死亡，均与加工肉类的摄入有关。这些特性使得李斯特菌在食品加工环境中难以彻底清除，从而强调了对其污染进行有效检测和控制的重要性。

传统的李斯特菌检测方法主要依赖于培养技术，尽管这种方法被认为是“金标准”，但其操作过程繁琐、耗时较长，难以满足现代食品安全监测对快速反应的需求。近年来，等温核酸扩增技术（如环介导等温扩增，LAMP）因其能够在短时间内高效扩增目标DNA而受到广泛关注。LAMP技术能够在恒温条件下，于1小时内扩增高达10?个DNA拷贝，显示出极高的灵敏度。然而，LAMP技术在实际应用中仍存在非特异性扩增和假阳性结果的问题，因此需要进一步优化以提高检测的准确性。

为了解决这一问题，科学家们尝试将CRISPR/Cas系统与LAMP技术相结合，开发出一种新型的检测方法。CRISPR/Cas系统是一类基因编辑工具，其中Cas12b（也称为C2c1）是一种依赖RNA的内切酶，能够在特定条件下精准切割目标核酸序列。当CRISPR/Cas12b与LAMP技术结合使用时，不仅可以提高检测的准确性，还能显著缩短检测时间。此前，有研究团队已经开发出基于LAMP和CRISPR/Cas12b的“一锅法”检测系统，用于检测包括新冠病毒在内的多种病原体，这种技术相较于传统的两步检测（先进行等温扩增，再进行CRISPR/Cas切割）更具优势。

在本研究中，研究人员开发了一种基于*lmo0753*基因的“一锅法”LAMP-CRISPR/Cas12b检测系统，并进一步整合了侧向流动检测（LFA）技术，从而实现了对检测结果的直接可视化。该方法不仅提高了检测效率，还降低了操作复杂性，使得检测结果能够通过肉眼快速识别。通过实验验证，该系统对九株不同血清型的李斯特菌样本均表现出良好的检测效果，且对其他非目标菌株（如*Listeria innocua*和其他常见的食源性病原体）无交叉反应，表明其具有较高的特异性。

此外，该方法在检测灵敏度方面也表现出色。在纯培养条件下，其检测限为每毫升10个菌落形成单位（CFU），而在猪肉样本中，检测限为每克20个CFU。这意味着即使在低浓度的污染情况下，该系统也能有效识别李斯特菌的存在。同时，该方法显著缩短了样品的富集时间。对于仅含有李斯特菌F2365的猪肉样本，富集时间可缩短至3小时；而对于含有多种混合细菌的猪肉样本，富集时间也仅为4至5小时，相较于传统方法大幅提升了检测效率。

在实际应用中，该方法对66份新鲜猪肉样本、20份即食食品样本和24份生牛奶样本进行了检测，结果发现其中5份猪肉样本、1份即食食品样本和2份牛奶样本检测出李斯特菌的存在，与传统的培养法检测结果一致。这表明，该系统不仅具备较高的检测准确性，还能够适用于多种食品样本的检测需求，为食品安全检测提供了新的技术路径。

该研究的创新之处在于首次将LAMP-CRISPR/Cas12b与LFA技术结合，实现了一种“一锅法”且无需复杂设备的检测系统。这种技术的整合不仅简化了检测流程，还降低了对专业设备的依赖，使得检测可以在现场或快速诊断环境中进行。LFA技术作为一种快速、简便的可视化检测手段，能够直接在试纸条上显示检测结果，大大提高了检测的可操作性和实用性。

综上所述，本研究开发的LAMP-CRISPR/Cas12b和LAMP-CRISPR/Cas12b-LFA检测系统为食品中李斯特菌的快速、高灵敏度和高特异性检测提供了可行的解决方案。该方法不仅提高了食品安全检测的效率，还为食品安全监管和疾病防控提供了强有力的技术支持。未来，随着技术的进一步优化和推广，这一检测系统有望成为食品安全检测领域的标准工具，为保障公众健康和食品安全发挥重要作用。