《Currents in Pharmacy Teaching and Learning》：Triptolide impacts CSF1R expression andreprograms the suppressive function of myeloid-derived suppressor cells via targeting the ER stress pathway
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三萜酸通过抑制内质网应激通路中的PERK减少肝细胞癌中CSF1R+髓系源性抑制细胞数量从而改善预后。
黄慧杰|梁国军|何耀宗|王洪宇|林晓文|赵子凌|梁恩宇|王云秀|彭建新|孙洪伟|何敏
中国广州中医药大学第二临床学院实验医学系
摘要
三萜醇（TPT）是一种存在于草药中的天然化合物，具有抗炎和抗肿瘤作用。本研究旨在探讨三萜醇对肝细胞癌（HCC）中髓源性抑制细胞（MDSCs）的治疗效果。通过对肝肿瘤活检样本进行单细胞转录组分析，发现Colony-Stimulating Factor 1受体（CSF1R+）MDSCs是HCC患者中一种独特的MDSC亚群，并且其表达水平与HCC的严重程度呈正相关。流式细胞术分析证实，CSF1R+ MDSCs在HCC患者的外周血和肿瘤组织中富集。此外，CSF1R在多形核MDSCs（PMN-MDSCs）亚群中的表达显著升高。值得注意的是，PERK介导的内质网（ER）应激可诱导CSF1R的表达；通过抑制PERK的活性（而非IRE1α或ATF6），能够有效降低CSF1R+ MDSCs的频率。进一步研究发现，TPT以剂量依赖的方式减少MDSCs和CSF1R+ MDSCs的数量，并缓解其对T细胞增殖的免疫抑制作用。实验还表明，TPT能够抑制PERK的磷酸化以及ATF4和C/EBPβ的蛋白表达。我们的研究结果强调了ER应激诱导的CSF1R表达在促进MDSCs免疫抑制作用、从而推动HCC疾病进展中的作用，并将CSF1R确定为TPT治疗HCC的一个有前景的免疫抑制靶点。
引言
肝细胞癌（HCC）是最常见的癌症类型之一，是全球癌症相关死亡的第三大原因[1]。免疫抑制性的肿瘤微环境（TME）是导致HCC发生、进展、转移和治疗抵抗的关键因素[2,3]。
髓源性抑制细胞（MDSCs）是人类实体瘤微环境中的主要组成部分。先前的研究已证实，MDSCs具有免疫抑制作用，包括抑制T细胞增殖/激活以及促进肿瘤血管生成[4]。因此，抑制MDSCs成为当前HCC免疫治疗中的一个重要方向[5]。目前，MDSCs主要分为两种亚型：单核细胞型（M-MDSC）和多形核细胞型（PMN-MDSC）[6]。然而，MDSCs的组成高度动态且异质性强，缺乏明确的标记物，这阻碍了对其生物学特性和临床意义的理解[7]。更重要的是，MDSCs在癌症中获得病理活性的机制尚未完全阐明。
Colony-stimulating factor 1受体（CSF1R）在调控髓系细胞稳态中起着关键作用。研究发现，CSF1R表达升高与具有免疫抑制微环境和不良预后的侵袭性肿瘤相关[8]。CSF1R的上调会增强肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的免疫抑制活性，促进肿瘤生长、血管生成、侵袭和转移[9,10]。然而，临床试验证明，单药阻断CSF1R对抑制肿瘤进展的效果有限[11]。CSF1R在髓系细胞中的双重作用以及局部微环境的影响加剧了这一挑战[12]。因此，全面阐明CSF1R在肿瘤内MDSCs发育过程中的调控机制可能为HCC免疫治疗开辟新的途径。
三萜醇（TPT）是中国草药三棱藤（Tripterygium wilfordii Hook f）的主要活性成分，几个世纪以来一直被用作抗炎和免疫抑制药物[13]。TPT及其衍生物对多种人类癌症（包括HCC）具有显著的抗肿瘤活性[14]。目前有多个TPT衍生物正处于I/II期临床试验阶段[15,16]。TPT通过调节免疫细胞的功能（如促使巨噬细胞向M2表型极化）发挥治疗效果[17,18,19]。然而，TPT在HCC中调节MDSCs分化和功能的机制及其信号通路仍不明确。
通过对HCC患者肝肿瘤活检样本进行单细胞转录组分析，我们发现了CSF1R+ MDSCs这一独特的细胞亚群。通过伪时间分析结合体外实验（使用ER抑制剂），证实了ER应激通路在MDSCs分化中的关键作用。此外，TPT通过下调蛋白激酶RNA激活的内质网激酶（PERK）通路，降低了MDSCs和CSF1R+ PMN-MDSCs的频率。我们的研究结果表明，ER应激诱导的CSF1R表达通过促进MDSCs的免疫抑制作用促进了HCC的疾病进展，并将CSF1R确定为TPT治疗HCC的一个新的免疫抑制靶点。
单细胞测序分析
我们从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中获取了GSE149614数据集的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，对6个原发性肿瘤样本和6个非肿瘤肝组织样本进行了分析，使用了“Seurat” R软件包[20]。排除了 mitochondrial含量超过10%或基因数量少于200个或超过8000个的细胞。同时，排除了被鉴定为双胞胎或三胞胎细胞（即同时表达多种细胞类型特异性标记物的细胞）。
单细胞RNA-seq分析发现HCC中的CSF1R+ MDSCs亚群
我们首先对HCC患者中的6个原发性肿瘤（T）样本和6个非肿瘤（NT）肝组织样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析。经过严格的质量控制后，最终获得了43,827个高质量细胞。利用UMAP方法，并结合已报道的细胞注释基因及与细胞簇相关的超高变异性基因，识别出11个主要细胞簇，这些细胞簇包含免疫细胞和非免疫细胞。
讨论
MDSCs是一类异质性的髓系细胞，在癌症中起着重要的免疫调节作用。精确解析MDSCs的组成有助于开发针对它们的治疗策略。我们的研究结果表明，HCC患者中CSF1R+ PMN-MDSCs的数量显著增加。PERK介导的ER应激驱动了CSF1R+ MDSCs的分化。此外，TPT通过抑制CSF1R+ MDSCs的分化和功能来发挥治疗作用。
CRediT作者贡献声明
黄慧杰：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据分析。
梁国军：方法学设计、数据分析。
何耀宗：方法学设计、数据分析。
王洪宇：资金筹集、数据分析。
林晓文：方法学设计、数据管理。
赵子凌：数据管理。
梁恩宇：资金筹集、数据分析。
王云秀：数据分析。
彭建新：数据管理。
孙洪伟：方法学设计、数据分析、数据管理。
何敏：资源支持。
资助
本研究得到了国家“中医湿证重点实验室”（SZ2021ZZ24）、教育部“基因工程重点实验室”（2023B1212060028）、“广州市基础与应用基础研究计划”（SL2024A04J00258）以及“广东省基础与应用基础研究基金会”（2023A1515012549）的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
