PD-L1抗体修饰的化学发光Au-Ag纳米合金，用于靶向检测肝癌细胞

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：PD-L1 antibody decorated chemiluminescence producing Au-Ag nanoalloys for targeted detection of hepatic cancer cells

PD-L1抗体修饰的金-银纳米合金（Au:Ag 1:3）通过增强化学发光信号选择性检测肝癌细胞，对比正常肝细胞（WRL-68）显著提升灵敏度和靶向性，为早期肝癌诊断提供新方法。

　　癌症的早期诊断对于提高患者的生存率、实现实时治疗监测以及降低死亡率至关重要。传统的诊断方法虽然在一定程度上取得了进展，但仍然存在诸如侵入性、高成本、有限的特异性以及难以检测早期病变等限制。因此，研究者们正在探索更先进的诊断技术，如化学发光（CL）检测系统，这些系统因其高灵敏度、无需激发光源以及生物组织中光散射较低而显示出替代传统诊断方法的潜力。本文提出了一种基于PD-L1抗体修饰的金-银（Au:Ag）纳米合金作为CL信号增强剂，用于肝癌细胞的靶向检测。

为了优化纳米合金的物理化学和催化性能，研究者们合成了不同摩尔比（3:1、1:1、1:3）的葡聚糖包覆的Au:Ag纳米合金。其中，摩尔比为1:3的Au:Ag纳米合金表现出最强的CL信号，这归因于其在过氧化氢（H?O?）分解中的优异催化活性，从而增强了鲁米诺（luminol）的氧化反应。此外，PD-L1抗体修饰的Au:Ag纳米合金（1:3）在生物缓冲液中表现出浓度依赖的CL信号增强，表明其在生物环境中的响应性。更重要的是，这些纳米合金在肝癌细胞（HepG2）中的结合能力显著强于正常肝细胞（WRL-68），显示出通过PD-L1抗体-配体相互作用实现的选择性靶向能力。这些发现突显了PD-L1抗体修饰的Au:Ag纳米合金在CL信号增强和早期肝癌细胞识别方面的应用潜力。

近年来，针对癌症细胞的靶向检测成为研究的热点，特别是在检测那些在癌症细胞表面过度表达、突变或特异性存在的生物标志物方面。例如，HER2（在乳腺癌细胞中表达）和PD-L1（在肺癌、肝癌及其他癌症类型中表达）因其诊断准确性和减少假阳性而被广泛使用。PD-L1是一种在肿瘤细胞和免疫细胞中表达的跨膜蛋白，作为重要的诊断和预后标志物，帮助识别可能从PD-1/PD-L1阻断治疗中获益的患者。其表达水平通常通过免疫组化（IHC）等分子技术进行评估，以帮助识别癌症亚型、预测疾病进展并指导靶向治疗的选择。

在这一背景下，PD-L1的检测方法不断得到改进，以提高其在癌症诊断中的准确性和灵敏度。例如，Moazzam等人开发了一种基于金包覆磁性纳米颗粒（Au@MNPs）的电化学检测方法，用于从全血中直接检测PD-L1，从而实现癌症诊断。该技术相较于传统的ELISA试剂盒，具有更快的检测时间和更高的灵敏度，大约提高了260,000倍。该检测方法的检测限极低（15 aM），并在15分钟内即可得出结果。同样，Jiang等人设计了一种基于Bi?Se?电极修饰的电化学传感器，结合PD-L1靶向肽，用于检测血清中的PD-L1。该传感器表现出优异的稳定性和选择性，检测限为1.07 × 10?11 mg/mL，并具有广泛的线性范围。这些研究显示，PD-L1修饰的纳米材料主要采用吸收光或荧光检测方法，而未涉及CL检测。

纳米颗粒（NPs）在癌症靶向诊断中的应用广泛，它们能够促进高灵敏度和特异性生物传感平台的开发。NPs具有可调的尺寸、形状和已知的表面化学性质，使得它们易于与目标配体（如抗体、肽、适配体或其他癌症特异性配体）进行表面修饰。金（Au）、银（Ag）、二氧化硅（SiO?）、氧化铁（FeO）和量子点（QDs）等不同类型的纳米颗粒已被广泛用于癌症检测和成像。这些纳米颗粒独特的光学、磁性和催化特性使得它们能够用于多种检测技术，包括荧光、磁共振、SERS、光声成像和CL。NPs能够催化反应，从而产生增强且可测量的信号，显著提高分析物的灵敏度并降低检测限。在这些信号增强的纳米材料中，金属纳米颗粒尤为突出，这得益于它们在已有核的基础上生长形成更大的颗粒，以及能够集中和放大有色产物的形成。

金和银是众多金属中值得注意的两种，因其出色的光学、催化和生物相容特性而被广泛研究。近年来，通过结合这两种金属形成双金属纳米合金成为一种有前景的策略，以优化两种成分的特性，包括增强的催化活性。金和银之间的协同作用提高了光学、电子和催化性能，使得纳米合金具有可调的等离子共振、增强的CL和对生物标志物的敏感检测能力。例如，利用Au–Ag合金空心纳米壳开发了一种三模式侧向流动免疫检测，用于检测SARS-CoV-2中和抗体。这些纳米壳能够实现比色、光热和SERS检测，具有高灵敏度和特异性。在合金中，Ag:Au比例（15:4）导致了增强的稳定性、近红外（NIR）吸收和检测性能。此外，Maturi等人合成了一种PEG稳定化的Au??-Ag??合金纳米三角形（约20 nm），用于光热癌症治疗。其合金结构提高了NIR吸收、光热效率和稳定性，有效杀死了胶质母细胞瘤细胞，同时保持良好的生物相容性，展示了Au–Ag合金在诊断和靶向癌症治疗中的协同优势。另外，Au–Ag合金纳米颗粒整合到玻璃碳电极上的共价有机框架（COF）中，用于非酶促电化学传感器以实时监测H?O?。该电极表现出?46.15 μA的催化电流（Au–AgNPs–COF > AuNPs–COF > AgNPs–COF > COF），检测H?O?的范围为2 nM–1 mM，检测限为0.44 nM。该生物传感器表现出强选择性、稳定性和可重复性，并在RAW 264.7细胞、人血清和胎牛血清中表现出良好的性能。尽管已有多种Au–Ag合金被开发并用于癌症和其他生物分子的敏感检测，但它们仍然面临复杂的合成方法和较差的催化活性等问题。此外，Au–Ag纳米合金在CL信号中的应用尚未有相关报道。

本研究合成并全面表征了一系列具有不同摩尔比（3:1、1:1、1:3）的Au–Ag纳米合金，以研究其组成对光学、结构和催化性能的影响。这些纳米合金被系统评估了其类过氧化物酶行为、催化4-硝基苯酚（4-NP）还原的能力以及在鲁米诺–H?O?体系中的CL性能。为了实现靶向癌症检测，纳米合金被包覆葡聚糖并修饰醛基，使得它们能够通过共价连接与抗PD-L1抗体结合。同时，研究者们评估了合成纳米合金在正常肝细胞（WRL-68）和肝癌细胞（HepG2）中的生物相容性，并随后通过CL信号输出进行体外肝癌细胞检测。结果表明，开发的CL检测系统在肝癌诊断中具有显著的潜力，能够作为靶向诊断平台。据我们所知，这是第一项利用抗PD-L1抗体修饰的Au–Ag纳米合金实现肝癌细胞CL信号增强的报道。

本研究中使用的材料包括氯金酸（HAuCl?）和H?O?，它们是从SD Fine Chemicals（印度孟买）购买的。葡聚糖-10、高碘酸钠（NaIO?）、硼氢化钠（NaBH?）、氢氧化钠（NaOH）、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）、抗生素-抗真菌混合物以及3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑盐（MTT）均购自Himedia（印度孟买）。南美来源的胎牛血清（FBS）是从Gibco（Thermofisher，印度）购买的，而cyQUANT LDH细胞毒性检测则用于评估纳米合金的生物相容性。

在Au–Ag纳米合金的合成和表征过程中，研究者们采用了不同的方法来优化其性能。通过UV-可见吸收光谱分析，仅AuNPs和AgNPs分别在529 nm和405 nm处表现出特征的表面等离子共振（SPR）信号。而具有不同Au和Ag比例（3:1、1:1、1:3）的纳米合金分别在492 nm、466 nm和400 nm处表现出SPR信号（见图1A）。随着Au中Ag浓度的增加，SPR信号向蓝移，表明纳米合金的光学特性受到其组成的影响。此外，纳米合金的结构和催化性能也受到其组成的影响，研究者们通过不同的实验方法对其进行了详细评估。

为了进一步提高纳米合金在CL检测中的性能，研究者们采用了共价修饰的方法，将抗PD-L1抗体连接到纳米合金表面。这种方法不仅提高了纳米合金与PD-L1的结合能力，还增强了其在生物环境中的检测效果。此外，研究者们还评估了纳米合金在正常肝细胞和肝癌细胞中的生物相容性，确保其在体外检测中的安全性和有效性。通过这些实验，研究者们能够验证纳米合金在CL检测中的应用潜力，并为未来开发更高效的癌症诊断方法提供理论依据。

综上所述，本研究提出了一种基于PD-L1抗体修饰的Au–Ag纳米合金作为CL信号增强剂，用于肝癌细胞的靶向检测。通过优化纳米合金的组成，研究者们能够显著提高其催化活性和CL信号强度，从而实现更精确和灵敏的癌症诊断。同时，纳米合金的生物相容性评估表明其在正常和癌变细胞中的应用具有可行性。这些结果不仅为CL检测方法提供了新的思路，也为癌症靶向诊断的发展提供了重要的参考价值。