再次发现并开展一种新型肽类放射性示踪剂的临床前评估，用于非小细胞肺癌中TROP-2的PET成像

《Bioorganic Chemistry》：De novo discovery and preclinical evaluation of a novel peptide radiotracer for PET imaging of TROP-2 in non-small cell lung cancer

R-loop介导的MARVELD3通过抑制TTC9激活MAPK通路促进口腔鳞状细胞癌进展。

　　

Xinyi Li|Xuerong Xiang|Jiao Huang|Tingxiu Xiang|Ping Ji

重庆医科大学附属口腔医院，中国重庆401147

摘要

目的

R-loop在多种癌症的进展中起着关键作用，但其与口腔鳞状细胞癌（OSCC）的关联尚未得到充分研究。本研究旨在探讨R-loop介导的MARVELD3在OSCC中的作用和机制。

方法

采用DRIP-seq技术评估R-loop在OSCC进展中的作用。通过RT-PCR、IHC和免疫荧光技术检测MARVELD3的表达及其与R-loop的关系。通过增殖实验、克隆形成实验、Transwell实验和流式细胞术研究MARVELD3在OSCC中的功能作用。进一步利用RNA-seq、Western blotting和定量PCR（qPCR）技术研究MARVELD3的调控机制。

结果

R-loop介导的基因失调在OSCC中具有重要的生物学意义。由于R-loop的积累，MARVELD3在OSCC细胞中高表达；敲低MARVELD3可降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而其过表达则会增强这些特性。机制上，MARVELD3通过抑制TTC9的表达来促进MAPK信号通路。

结论

总之，R-loop的积累促进了MARVELD3的转录。MARVELD3通过下调TTC9和激活MAPK信号通路，在OSCC中发挥促肿瘤作用。

引言

口腔癌是全球第13大常见癌症类型，2020年估计有377,000例新发病例和177,757例死亡病例[1]。其中，口腔鳞状细胞癌（OSCC）是最主要的类型，占所有口腔癌病例的约90%[2]。尽管已进行了大量研究以揭示其病因并改进治疗方法，但OSCC患者的总体预后仍然不佳，5年生存率仅为约60%[2]。由于对在OSCC进展中起关键作用的因素了解不足，有效治疗策略的开发受到了显著阻碍[2,3]。

R-loop是一种复杂的三链核酸结构，由RNA-DNA杂交体与替代的单链DNA（ssDNA）组成，在多种细胞过程中发挥重要作用[4]。R-loop不仅是结构实体，还是维持基因组稳定性的关键因素，对基因表达和DNA复制具有调节作用[5]。然而，R-loop的持续积累会导致ssDNA暴露于多种有害物质中，增加其与复制叉碰撞的风险，从而严重干扰转录过程，引发复制压力，并最终损害基因组完整性，对细胞功能产生连锁负面影响[6,7]。近期研究表明，R-loop在多种癌症的发病机制和进展中起着重要作用[8,9]。尽管有这些证据，但R-loop在OSCC发病机制中的具体作用尚未明确，这在我们对其在该恶性肿瘤中作用的理解上存在空白。

与R-loop相关的Marvel蛋白（TAMP）包括occludin、tricellulin（也称为MARVELD2）和含MARVEL结构域的蛋白质3（MARVELD3）[10]。MARVELD3在多种组织中广泛表达。一些研究表明，MARVELD3可抑制上皮-间充质转化（EMT）和肝细胞癌细胞的迁移；此外，敲低MARVELD3会影响上皮细胞的旁细胞通透性[11]。在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中，MARVELD3通过抑制Wnt/β-catenin通路来抑制转化生长因子-β1诱导的EMT[12]。MARVELD3还被认为可能是OSCC的潜在诊断标志物[13]，尽管其在OSCC中的具体作用和生物学机制仍不清楚。

先前的研究表明，TTC9是一种在癌症研究中备受关注的蛋白质，其在乳腺癌细胞中受多种激素的精细调控，这意味着它可能在癌细胞侵袭和转移的复杂过程中起关键作用，从而影响疾病的进展和扩散[14]。然而，TTC9在OSCC中的表达和功能尚不清楚。

本研究发现，R-loop介导的MARVELD3在OSCC中高表达，并具有促肿瘤作用。机制研究表明，MARVELD3通过下调TTC9和激活MAPK信号通路来促进肿瘤发生。

章节片段

样本收集

从重庆医科大学附属口腔医院收集了36名OSCC患者的肿瘤标本及其匹配的邻近组织。每位患者均签署了知情同意书，该研究已获得医院伦理委员会的批准（CQHS-REC-2023, LSNO.080）。

细胞培养

SCC-25、CAL-27和293T细胞系购自iCell Bioscience Inc.（上海）。CAL-27和293T细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，而SCC-25细胞则在其他培养基中培养

鉴定OSCC中R-loop介导的差异基因

R-loop失调会促进基因组不稳定，并与癌症发生相关[7]。为阐明R-loop形成在OSCC发病机制中的作用，我们首先收集了三对OSCC组织及其匹配的非癌性邻近组织样本，通过DRIP-seq技术检测两组之间的R-loop模式差异（图1A）。测序结果显示，OSCC组织中有3832个mRNA基因的R-loop形成发生了显著变化

讨论

OSCC是最常见的口腔恶性肿瘤，其发病率在全球范围内呈上升趋势[1]。其病因主要与吸烟、饮酒和HPV感染等风险因素有关[17]。分子生物学研究发现了多种导致OSCC发生的基因突变和信号通路[18]。尽管近年来诊断和治疗方法有所进步，但OSCC的死亡率仍然很高，这凸显了研究的紧迫性

结论

在OSCC中，MARVELD3的表达与细胞增殖和转移有关。MARVELD3似乎通过下调TTC9表达来激活MAPK信号通路。虽然MARVELD3具有作为OSCC生物标志物和治疗靶点的潜力，但这些发现为OSCC的发病机制提供了新的见解。

作者贡献声明

Xinyi Li：撰写初稿、数据可视化、验证、软件使用、项目管理、方法设计、实验实施、数据分析。Xuerong Xiang：监督、软件使用。Jiao Huang：撰写初稿、数据验证、项目管理、数据分析、数据管理。Tingxiu Xiang：撰写与编辑、数据可视化、验证、监督、数据管理、概念构思。Ping Ji：撰写与编辑、数据验证、资金筹集、概念构思。

伦理批准声明

所有实验均符合相关法律法规和机构指南，并已获得相应机构委员会的批准。本研究已获得医院伦理委员会（CQHS-REC-2023, LSNO.080，2023年4月7日）的批准。尊重了受试者的隐私权，并获得了他们的知情同意。所有动物实验均获得了重庆肿瘤医院的批准

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：82071115、82220108019）的支持。