异亮氨酸双加氧酶的工程改造，用于高效的多酶级联合成(2S, 3R, 4S)-4-羟基异亮氨酸

《Bioorganic Chemistry》：Engineering of isoleucine dioxygenase for efficient multi-enzymatic cascade synthesis of (2 S, 3 R, 4 S)-4-hydroxyisoleucine

（2S,3R,4S)-4-羟基异亮氨酸通过工程化铁离子/α-酮戊二酸依赖性异亮氨酸 dioxygenase（IDO）及优化整细胞生物催化系统实现高效合成。研究采用定向进化策略获得突变体MU3（V146I/S105E/N104P），其催化效率提升15倍，热稳定性提高10倍，分子动力学模拟显示活性位点周围结构变化增强了底物结合能力。通过整合L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶构建的整细胞催化系统，在放大条件下实现500-750 mM L-异亮氨酸完全转化，时空产率达196 g/(L·d)，较传统方法成本降低42美元/kg。

　　这项研究聚焦于一种名为（2S，3R，4S）-4-羟基异亮氨酸的抗糖尿病药物的高效合成方法。该化合物具有调节血糖、控制体重和改善肝功能等多重生理作用，因此在糖尿病治疗领域展现出广阔的应用前景。然而，目前该化合物的工业生产面临诸多挑战，包括酶活性不足、稳定性差以及α-酮戊二酸（α-KG）作为辅底物的成本过高。为了解决这些问题，研究团队采用多种工程策略对一种来源于苏云金芽孢杆菌的异亮氨酸双氧酶（IDO）进行了改造，并构建了一个优化的全细胞催化系统，实现了该化合物的高效、低成本和可扩展合成。

在生物催化过程中，IDO是一种依赖于Fe(II)和α-KG的酶，其催化机制能够选择性地在L-异亮氨酸的C4位引入羟基，从而生成目标产物（2S，3R，4S）-4-HIL。尽管这种方法具有步骤简单、环境友好和高立体选择性的优点，但天然IDO的催化效率和稳定性仍难以满足工业化需求。因此，研究团队通过定向进化、结构优化和高通量筛选等手段对IDO进行了系统改造，成功获得了具有显著提升性能的三重突变体MU3（V146I/S105E/N104P）。这一突变体不仅表现出15倍于原始酶的比活性（达到152.0 U/mg），而且其催化效率（kcat/Km）也提高了15倍，这意味着它能够更高效地将L-异亮氨酸转化为所需的羟基化产物。

为了进一步提高合成效率，研究团队设计了一个全细胞催化模块，该模块整合了L-谷氨酸氧化酶（LGOX）和过氧化氢酶（CAT），以实现α-KG的原位生成。LGOX能够将L-谷氨酸钠转化为α-KG，而CAT则负责将反应过程中产生的过氧化氢转化为氧气和水，从而避免副产物对反应体系的干扰。这种全细胞催化系统不仅降低了α-KG的依赖，还减少了传统方法中所需的昂贵辅底物成本，同时简化了操作流程，提高了生产效率。

通过构建一个分步式的全细胞生物催化级联系统，研究团队实现了在扩大规模条件下，将500 mM和750 mM的L-异亮氨酸完全转化为（2S，3R，4S）-4-HIL。实验结果表明，该系统在生产过程中能够达到196 g/L/d的最高空间时间产率，这一数值远超现有方法的水平。同时，由于减少了对高成本辅底物的需求，整体生产成本也显著降低，为该化合物的工业化生产提供了经济可行的路径。

为了验证突变体MU3的性能提升，研究团队利用分子动力学模拟技术分析了其结构变化。模拟结果显示，围绕活性位点的环状结构之间的通讯改变，以及对底物结合能力的增强，是MU3表现出更高催化效率和稳定性的关键因素。这些结构上的优化不仅提升了酶的性能，还增强了其在实际生产条件下的适应性。

在实际应用中，传统的IDO催化反应通常需要外部添加α-KG作为辅底物，这不仅增加了生产成本，还可能影响反应的环境友好性。而通过构建全细胞催化模块，研究团队成功实现了α-KG的原位生成，从而避免了外部添加的需要。这种策略不仅提高了生产效率，还为可持续发展提供了支持，因为L-谷氨酸钠是一种价格低廉且易于获取的原料。

此外，研究团队还开发了一种基于α-KG显色反应的高通量筛选方法，用于评估IDO突变体的催化活性。这种方法能够快速、准确地检测α-KG的消耗情况，从而间接反映IDO的活性水平。通过这一方法，团队能够高效筛选出性能最优的突变体，为后续的工程优化奠定了基础。

在实际生产中，高通量筛选方法的引入极大地提高了实验效率，使得研究人员能够在短时间内评估大量突变体的性能。这种方法不仅节省了时间和资源，还为大规模生产提供了技术支持。通过不断优化突变体和全细胞催化系统，研究团队成功构建了一个能够实现高效、低成本和可扩展生产的生物催化体系。

该研究的成果为（2S，3R，4S）-4-HIL的工业合成提供了一条全新的路径。传统的化学合成方法不仅步骤复杂，还可能产生严重的环境污染，而生物催化方法则以其环境友好性和高立体选择性受到广泛关注。然而，由于天然IDO的活性和稳定性不足，其在工业应用中的潜力一直受到限制。通过本研究的工程改造，IDO的性能得到了显著提升，从而使得其在实际生产中的应用成为可能。

全细胞催化系统的构建是本研究的另一大亮点。与传统的酶促反应相比，全细胞催化系统无需进行细胞裂解和酶纯化，这不仅降低了催化剂的制备成本，还提高了反应的稳定性。此外，全细胞系统能够在反应过程中维持酶的活性，避免了在传统方法中可能出现的酶失活问题。这种策略的引入，使得整个合成过程更加高效和经济。

在实际应用中，该生物催化系统展现出了良好的适应性和可扩展性。研究团队通过分步式级联反应，成功实现了在较高浓度底物条件下的高效转化。这表明该系统不仅适用于实验室规模的反应，还能够满足工业生产的需求。此外，该系统的高产率和低成本也使其在实际应用中具有显著优势。

总的来说，这项研究通过多策略的酶工程和全细胞催化系统的优化，成功解决了（2S，3R，4S）-4-HIL合成中的关键问题。不仅提升了酶的催化效率和稳定性，还实现了辅底物的低成本生成，为该化合物的工业化生产提供了可行的技术路径。这一成果对于推动抗糖尿病药物的绿色合成具有重要意义，同时也为其他类似化合物的生物催化合成提供了参考价值。