发现含有N-磺酰吡唑结构单元的大环衍生物，作为新型强效的血细胞生成祖细胞激酶1抑制剂

《Bioorganic Chemistry》：Discovery of macrocyclic derivatives bearing N-sulfonyl-pyrazole moiety as new potent hematopoietic progenitor kinase 1 inhibitors

本研究通过引入N-磺酰基吡唑单元优化宏观环结构，开发出新型HPK1抑制剂，化合物14表现出1.7 nM的高效抑制HPK1活性，对GLK和LCK具有显著选择性，口服生物利用度达22.8%，且与抗PD-1抗体联用具有协同抗肿瘤效果。

　　

李王|李子龙|段成祥|杨秀琴|王海通|顾轩瑞|王国强|程倩辉|王明书|佘能芳|史星星|黄伟

中国华中师范大学绿色农药国家重点实验室，武汉，430079，中华人民共和国

摘要

造血祖细胞激酶1（HPK1）由于其在细胞内对T细胞受体（TCR）信号传导的负调控作用，已成为抗肿瘤免疫治疗的一个有前景的目标。大环化是一种有效的策略，可以解决开发HPK1抑制剂时面临的主要挑战，因为它能够在抑制效果、激酶选择性和药代动力学特性之间取得平衡。在此，我们继续采用这一策略，并报道了一系列N-磺酰吡唑类大环HPK1抑制剂。化合物14表现出优异的HPK1抑制活性，IC50值为1.7 nM，并且对GLK和LCK具有显著的选择性，分子建模研究表明这是由于环丙基磺酰基与激酶结构域中不同残基的相互作用所致。化合物14还显示出良好的人体肝微粒体稳定性（T1/2 = 147.3分钟）和相当高的口服生物利用度（F = 22.8%）。更重要的是，

在MC38同源肿瘤小鼠模型中，化合物14与抗PD-1联合使用显示出叠加的协同效应，TGI%值为89%，这种效应在进一步的亚组分析中更为明显。这些结果表明，化合物14与抗PD-1抗体联合使用为对现有免疫治疗反应不佳的患者提供了一种新的治疗方案。

引言

癌症免疫治疗在多种恶性肿瘤的治疗中取得了令人鼓舞的效果，被认为是癌症治疗领域的重大科学突破[[1], [2], [3]]。然而，目前的肿瘤免疫疗法仅通过细胞外途径（如最常用的免疫检查点抑制剂（ICIs）来调节和激活免疫细胞，这些抑制剂只能干扰位于免疫细胞膜上的负反馈信号[[4], [5]]。它们无法有效应对由细胞内信号传导介导的复杂癌症免疫逃逸现象[[6], [7], [8], [9], [10]]。因此，癌症免疫治疗的有效性和响应率往往受到限制[[7]]。迫切需要发现新的细胞内免疫调节靶点，以补充和增强现有的免疫疗法。

造血祖细胞激酶1（HPK1），也称为有丝分裂原活化蛋白激酶1（MAP4K1），是T细胞受体（TCR）信号传导的关键细胞内负调节因子[[11], [12], [13]]。HPK1是一种丝氨酸/苏氨酸Ste20相关蛋白激酶，主要在造血细胞中表达[[11],[13],[14]]。当TCR被激活时，细胞内的HPK1被招募到质膜上，并通过上游激酶LCK和ZAP-70在Tyr 381位点磷酸化而被激活。活化的HPK1随后诱导SLP76在Ser376位点磷酸化，从而介导SLP76与14–3-3Π（一种负调节蛋白）之间的相互作用，导致TCR信号复合体的不稳定，进而抑制T细胞的激活和增殖[[15], [16], [17], [18], [19]]。先前的研究表明，HPK1的高表达与T细胞耗竭和免疫功能抑制有关[[13], [14], [20]]。抑制HPK1可以提高肿瘤抗原的识别能力并增强抗肿瘤效果[[17,20]]。此外，同时阻断HPK1和PD-1/PD-L1能够协同促进抗肿瘤免疫反应[[21], [22], [23]]。因此，近年来制药公司和学术界都致力于开发针对HPK1的抑制剂，作为潜在的癌症免疫治疗药物（图1）[[24], [25], [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]]。其中，化合物14具有独特的大环骨架，我们之前的研究显示其具有较高的HPK1抑制活性以及对GLK（MAP4K3）的卓越选择性。GLK是一种与HPK1具有相似序列和结构但T细胞信号传导效应相反的蛋白质，因此对GLK的选择性对于HPK1抑制剂来说是一个具有挑战性但至关重要的目标[[37], [38], [39], [40]]。

鉴于大环化仍然是解决开发HPK1抑制剂时面临的主要挑战（抑制效果、激酶选择性和药代动力学特性的平衡）的有效策略[[24],[30],[31],[40],[41]]，我们成功将N-磺酰吡唑单元引入大环骨架中，发现了一系列新型大环HPK1抑制剂。代表性化合物14的HPK1抑制活性IC50值为1.7 nM，对GLK和LCK具有显著的选择性，并具有良好的药代动力学特性。更重要的是，化合物14在与抗PD-1抗体联合使用时，在MC38模型中显示出协同的抗肿瘤效果，并具有提升临床反应的潜力。

结果与讨论

基于结构的药物设计。我们的药物化学研究始于化合物8，该化合物在我们早期的工作中也被报道为先导化合物[[31]]。化合物8表现出良好的HPK1抑制活性和对GLK的选择性。然而，化合物8在人体肝微粒体中代谢迅速（T1/2 = 32.1分钟，CLint = 43.2 μL/分钟/毫克蛋白质），我们认为这是由于其未取代的吡唑结构所致（图2）。我们之前的成功经验表明...

结论

由于HPK1在TCR信号传导中的关键作用，它被广泛认为是免疫治疗的一个有吸引力的靶点。在已报道的HPK1抑制剂中，化合物4所具有的大环骨架因其能够在效力、选择性和药代动力学特性之间取得平衡而脱颖而出。在这项工作中，我们通过基于结构的药物设计，报道了一系列N-磺酰吡唑类大环衍生物，并对先导化合物8进行了代谢优化。

实验部分

通用化学。除非另有说明，所有化学试剂和有机溶剂均来自商业渠道，未经进一步纯化直接使用。化合物的纯化采用200–300目硅胶进行色谱分离。所有反应均在F254或F365光线下通过硅胶板薄层色谱（TLC）进行监测。对空气或湿气敏感的反应在氩气氛围下进行。核磁共振（¹H和¹³C NMR）谱图...

CRediT作者贡献声明

李王：撰写 – 原始草稿、方法学、实验研究、数据分析。李子龙：项目管理、实验研究、概念构思。段成祥：验证、方法学、实验研究、数据分析。杨秀琴：方法学、实验研究。王海通：实验研究。顾轩瑞：数据可视化。王国强：实验研究。程倩辉：方法学、实验研究。王明书：概念构思。佘能芳：撰写 – 审稿与编辑、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家关键研发计划（2022YFD1700200）、湖北省自然科学基金（2023AFB987）、中国国家创新人才博士后计划（BX20240133）、中国博士后科学基金（2025M773810）以及中央高校基本科研业务费（CCNU25JC030）的支持。