可注射的CRISPRa微球通过靶向激活A20蛋白，减轻衰老过程，从而改善与年龄相关的骨生成障碍

《Biomaterials》：Injectable CRISPRa-microspheres for targeted A20 activation rescue age-related osteogenic impairment via senescence mitigation

衰老相关骨再生失败源于慢性炎症诱导的骨髓间充质干细胞衰老，本研究开发CRISPRa基因编辑微球载体，通过微流控合成的脂质纳米颗粒递送dCas9-VP64/sgRNA复合体，精准激活A20调控干细胞衰老-骨生成轴，在体内外实验中显著改善骨再生和血管化。

　　这项研究聚焦于解决与年龄相关的骨缺损修复失败这一重要的临床难题。随着年龄增长，骨密度下降和结构退化成为老年人常见的并发症，这不仅影响骨骼的强度和韧性，还增加了骨折的风险以及随后的骨丢失。目前的治疗策略在实际应用中存在诸多局限，例如愈合反应迟缓和固定稳定性不足，这些因素导致了临床效果不佳。究其根本，这些挑战主要源于老年人体内普遍存在的慢性炎症微环境，它促进了骨髓基质细胞（BMSCs）的衰老并削弱了其成骨能力。BMSC功能的下降严重阻碍了骨折修复过程，同时加剧了骨脆性。此外，骨质量的减少以及骨组织的定性退化进一步影响了植入物的稳定性，提高了治疗失败和术后并发症的可能性。

尽管已经认识到BMSC衰老是有效骨再生的核心障碍，但关于在炎症微环境下细胞衰老与成骨分化之间的分子机制仍不明确。因此，开发个性化的治疗方案，以恢复细胞衰老与成骨之间的平衡，成为迫切的临床需求。在这一背景下，研究团队提出了一种创新的解决方案：利用CRISPRa基因编辑技术，结合微流控合成的脂质纳米颗粒（cLNPs），构建了一种可注射的基因编辑微球（GEMs），用于同时递送dCas9-VP64和特定的sgRNA。这种平台能够实现对骨髓基质细胞中肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3/A20）的时空精确激活，从而重新调控衰老与成骨之间的平衡。

A20作为一种重要的负反馈调节因子，在炎症反应中发挥关键作用。已有研究表明，A20基因的遗传变异，如单核苷酸多态性（SNPs），与多种炎症性疾病密切相关，包括炎症性肠病（IBD）、系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿性关节炎（RA）。除了其已知的抗炎功能，A20还调节细胞的存活和分化，特别是在自然杀伤（NK）细胞和CD4+ T细胞中，通过抑制mTOR通路发挥作用。在小鼠模型中，A20的缺失会导致新生期死亡，这是由于不受控制的炎症反应和多器官衰竭，突显了其在免疫稳态中的关键作用。值得注意的是，越来越多的证据表明，A20也参与了细胞衰老过程，进一步强调了其在维持组织完整性中的重要性。

然而，A20的表达在炎症反应中具有动态性。在脂多糖（LPS）诱导的模型中，A20水平会在短时间内达到峰值，例如在肝纤维化过程中6小时后或在椎间盘退化的早期阶段，随后即使在持续的炎症刺激下，其表达水平也会回落至基础水平。这种短暂的上调有助于对急性炎症反应的即时保护，但其无法在慢性炎症条件下维持高水平表达，从而限制了长期的保护作用。因此，长期的炎症反应会超出A20的补偿能力，导致细胞衰老、功能障碍和组织退化。在年龄相关的骨缺损情况下，尚不清楚是否可以通过持续激活A20来有效恢复在慢性炎症微环境中衰老与成骨之间的平衡。持续的A20激活可能在克服自然的短暂反应方面发挥关键作用，从而提供持久的抗炎效果，并防止炎症诱导的细胞衰老。

近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术的进展为人类疾病的治疗策略带来了革命性的变化。与传统的病毒载体或siRNA方法相比，CRISPR-Cas9具有更高的编辑效率和较低的免疫原性。其精准、组织特异性靶向能力以及在不同微环境中的适应性，进一步增强了其在上下文相关基因调控中的潜力。这一领域的一个重要创新是脂质纳米颗粒（LNPs）的使用，它能够有效将CRISPR-Cas9 mRNA递送至靶细胞，确保准确且安全的基因组修改。该递送平台已经在治疗遗传性疾病如莱伯先天性黑蒙（LCA）、镰状细胞病和血友病方面显示出良好的应用前景。

将CRISPR-Cas9与先进的生物材料递送系统相结合，如水凝胶微球和脂质纳米颗粒，扩展了靶向基因治疗的应用范围，并提高了细胞摄取效率。这些系统能够实现药物的精准定位和持续释放，从而拓宽治疗的可能性。然而，年龄相关的骨缺损所涉及的病理微环境带来了独特的挑战。慢性炎症会诱导氧化应激，这不仅加速了干细胞的衰老，损害了成骨分化，还破坏了递送载体的稳定性，影响了细胞的内化过程。这些因素共同削弱了CRISPR-Cas9的活性和编辑效果，凸显了开发适用于慢性炎症环境的微环境响应型递送策略的迫切需求。

水凝胶微球因其良好的生物相容性、局部注射性和可控的持续释放能力，被广泛认为是先进的药物和基因递送平台。这些特性使其特别适合于骨缺损修复的临床应用。然而，年龄相关的骨缺损也带来了特殊的挑战，如骨密度降低、骨小梁结构稀疏和缺损几何形状不规则，这些因素影响了内固定稳定性。因此，迫切需要开发能够应对年龄相关骨缺损复杂机械和生物特性的微环境适应型策略。

生物打印技术为这一难题提供了一种有前景的解决方案，它能够制造出符合患者个体需求的支架，精确匹配不规则的骨缺损几何形状。除了结构上的定制化，生物打印支架还可以整合生物活性因子，如抗炎细胞因子和成骨肽，从而创建一个模拟生理环境的微环境，促进干细胞的增殖和分化。此外，这些支架还能作为基因编辑工具的储库，实现基因编辑物质的持续、局部递送。虽然初步研究显示了将微流控合成的脂质纳米颗粒整合到生物打印水凝胶中的可行性，但进一步优化仍然是确保支架设计在年龄相关骨缺损微环境的氧化和炎症条件下保持CRISPR活性的关键。

在本研究中，研究团队对年轻与年老小鼠的BMSC基因表达差异进行了全面分析。研究结果揭示了一个关键的补偿机制：A20在年老BMSC中显著上调。通过一系列功能实验，包括增殖、成骨分化和细胞因子分泌分析，研究团队证明了A20在年老BMSC中调节细胞衰老与成骨之间的失衡。基于这一发现，研究团队设计了一种基因递送支架（GES），通过将微流控合成的脂质纳米颗粒（cLNPs）整合到3D生物打印支架中，实现了CRISPR激活组件（dCas9-VP64和特定的sgRNA）的持续、局部递送。该平台能够在年龄相关的骨缺损的炎症微环境中，通过转录激活方式上调A20的表达。

在体外实验中，GES-A20系统显著促进了成骨分化，表现为ALP活性增加了5.0倍，矿化水平也提高了4.7倍。同时，该系统明显降低了衰老标志物，其中p16水平下降了30.4%，SA-β-Gal+细胞群体减少了66.7%。此外，该系统还抑制了炎症细胞因子，如TNF-α下降了27.4%，IL-6下降了32.0%。在体内实验中，GES-caA20支架在8周内显著促进了年老小鼠的骨再生，并增强了血管生成，表现为缺陷区域CD31+血管数量增加了3.1倍。整体来看，这项研究通过解决在慢性炎症微环境中持续基因激活的难题，推动了基于CRISPR的治疗策略的发展。个性化的支架设计能够有效匹配不规则的骨几何形状，并通过A20的激活恢复细胞衰老与成骨之间的微妙平衡。这些发现为治疗年龄相关的骨缺损提供了一种有前景、可转化的方案，并可能推广到其他由干细胞驱动的退行性疾病。