共转录2'-羟基修饰增强合成mRNA的核糖核酸酶抗性及脂质纳米颗粒热稳定性研究

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Co-transcriptional modifications of 2′-hydroxyls on synthetic mRNA enhance ribonuclease resistance and lipid nanoparticle thermostability

本研究针对mRNA因2'-羟基易受酶解和水解导致稳定性差的问题，通过T7 RNA聚合酶突变体实现2'-O-甲基/2'-氟修饰mRNA的共转录合成。修饰后mRNA在血清环境中稳定性显著提升，且修饰mRNA脂质纳米颗粒在25℃储存7天后仍保持较高活性，为mRNA药物的长效储存提供了新策略。

　　

随着辉瑞/BioNTech和Moderna等COVID-19 mRNA疫苗的成功获批，信使RNA（mRNA）作为一种新型治疗方式受到日益广泛的关注。mRNA基因药物在疫苗、癌症治疗和基因编辑等领域展现出巨大潜力。然而，mRNA分子固有的脆弱性成为其临床应用的主要障碍——核糖上的2'-羟基（2'-OH）不仅使其易受无处不在的核糖核酸酶（RNase）的酶促降解，还容易发生自发的水解反应，导致mRNA体内稳定性差、全球分销困难，且需要极低温度储存。

尽管目前通过将mRNA封装入脂质纳米颗粒（LNP）中可以一定程度上阻止RNase的侵袭，但LNP内部的mRNA仍然面临热稳定性差的问题。这主要归因于mRNA固有的水解倾向，使得mRNA-LNP制剂必须依赖冷冻链储存，极大限制了其广泛应用。

针对这些挑战，德克萨斯大学西南医学中心的Daniel J. Siegwart团队在《Molecular Therapy: Nucleic Acids》上发表了一项创新研究。研究人员开发了一种基于体外转录（IVT）的mRNA 2'-核糖修饰策略，通过使用T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）突变体，成功将2'-O-甲基（2'-O-Me）和2'-氟（2'-F）修饰引入合成mRNA，系统评估了这些修饰对mRNA稳定性和活性的影响。

关键技术方法包括：利用T7 RNAP突变体（Mutant X和Mutant Y）进行体外转录合成修饰mRNA；通过毛细管电泳（CE）分析mRNA完整性；采用RNase T1、RNase A和血清稳定性实验评估mRNA酶稳定性；使用HEK293T细胞模型和小鼠体内实验检测mRNA翻译活性；利用动态光散射（DLS）和电泳光散射（ELS）表征LNP理化性质；采用加速稳定性实验（25℃储存）评估LNP制剂的热稳定性。

T7 RNAP突变体实现2'-O-Me和2'-F修饰mRNA的合成

研究人员选取了临床已获批RNAi疗法中广泛应用的2'-O-Me和2'-F修饰，通过T7 RNAP突变体在IVT反应中用修饰核苷酸替代标准2'-OH核苷酸。实验发现Mutant X可接纳所有四种2'-O-Me-NTPs（核苷酸三磷酸），但仅能掺入2'-OH-CTP和2'-OH-GTP；而Mutant Y可同时接纳2'-OH-NTPs和2'-F-dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸），但当所有四种NTPs均被替代时转录活性完全丧失。这些发现验证了T7 RNAP变体在合成2'-修饰mRNA中的实用性。

2'-O-Me和2'-F修饰有效保护mRNA免受RNase介导的降解

通过系统评估不同修饰模式的mRNA对RNase T1（特异性切割G残基）和RNase A（特异性切割C/U残基）的抗性，研究发现完全2'-O-Me修饰的mRNA（100%修饰）在RNase混合处理中表现出最强的稳定性。在含0.1%胎牛血清（FBS）的PBS缓冲液中，重度修饰的2'-O-Me mRNA（75%修饰）和完全修饰mRNA可保持72小时完整。

对于2'-F修饰mRNA，研究人员设计了G特异性替换（25%-100%）和全核苷酸替换（20%-80%）两组梯度。实验表明G特异性2'-F修饰对RNase T1的抗性随修饰比例增加而线性增强，而全核苷酸2'-F修饰对两种RNase均提供更强保护。血清稳定性实验进一步证实，重度2'-F修饰mRNA（60%-80%修饰）的降解速度显著慢于未修饰或轻度修饰mRNA。

2'-修饰mRNA翻译效率降低但仍保持活性

细胞实验显示，2'-O-Me修饰mRNA的翻译效率比未修饰mRNA降低约100倍，但即使完全2'-O-Me修饰的mRNA仍可检测到活性。2'-F修饰mRNA的翻译效率随修饰比例增加而逐步下降，80%修饰的mRNA在相同剂量下未检测到信号。体内实验进一步验证，2'-O-Me mRNA（100%修饰）和2'-F mRNA（20%修饰）LNP肌肉注射后均可产生可检测的荧光素酶活性，且2'-F修饰mRNA表现出更持续的翻译动力学特征。

2'-修饰mRNA提升LNP制剂储存稳定性

研究人员使用COVID-19疫苗中采用的离子化脂质（ALC-0315和SM-102）制备LNP，在25℃储存7天后评估其稳定性。结果表明，2'-O-Me和2'-F修饰mRNA LNP的粒径、多分散指数（PDI）和包封效率均保持稳定，且活性衰减显著慢于未修饰mRNA LNP。通过CE分析从储存后LNP中提取的mRNA完整性，发现修饰mRNA的部分降解片段比例更低，证实2'-修饰可有效延缓mRNA在LNP内的降解。

研究讨论部分指出，2'-核糖修饰通过空间位阻或阻碍核糖体易位机制影响翻译过程，这种稳定性与翻译活性的平衡可通过调整修饰比例进行精细调控。虽然2'-O-Me修饰可抑制Toll样受体（TLR）激活降低免疫原性，但2'-F修饰可能增强细胞质解旋酶（如RIG-I和MDA-5）的感知，提示需根据治疗需求选择合适修饰策略。

该研究首次系统证明共转录2'-修饰可同时增强mRNA的酶稳定性和LNP热稳定性，为突破mRNA药物储存和运输瓶颈提供了创新解决方案。尽管修饰mRNA翻译效率有所降低，但这种可控的活性衰减可能在某些治疗场景（如持久疗效和减少给药频率）中产生积极影响。未来研究需进一步评估修饰mRNA长期安全性和生物分布，并通过高通量筛选探索更多修饰组合的优化潜力。