转录因子ZNF263通过抑制多能性核心网络并激活谱系分化基因调控胚胎干细胞多能性状态转换与谱系启动

《Nature Communications》：Transcription factor ZNF263 primes human embryonic stem cells for pluripotency dissolution and lineage commitment

本研究揭示了转录因子ZNF263在人类胚胎干细胞（hESCs）多能性状态调控中的关键作用。研究人员通过表观基因组分析和功能实验发现，ZNF263通过直接激活早期分化基因表达并抑制核心多能性因子（OSN）网络，建立了hESCs的primed多能性状态。ZNF263缺失显著损害hESCs的多能性退出和多谱系分化能力，特别是向ectoderm的分化。单细胞转录组分析表明ZNF263促进细胞命运承诺的启动，揭示了其在多能性启动和谱系连续过程中的不可或缺性。

　　

在干细胞生物学领域，人类胚胎干细胞（hESCs）具有自我更新和分化为所有三个胚层细胞的独特能力，但这种多能性状态实际上是一个动态连续统。常规培养的hESCs处于一种"primed"（准备）状态，其特征是同时表达多能性基因和低水平的谱系相关基因，使细胞处于分化准备状态。然而，调控这种primed多能性状态建立和维持的关键转录因子及其分子机制仍不清楚。

为了解决这一重要问题，来自上海营养与健康研究所的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们发现锌指转录因子ZNF263在hESCs的多能性状态调控中发挥着至关重要的作用。通过综合运用计算生物学筛选、表观基因组分析和功能实验，研究人员揭示了ZNF263如何通过独特的调控机制平衡多能性维持和谱系启动。

研究人员首先通过表观基因组数据的计算分析，发现ZNF263 motif与hESCs特异的活性启动子区域显著相关。进一步的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）实验证实ZNF263广泛结合在与多能性和干细胞分化相关基因的启动子区域。有趣的是，ZNF263与核心多能性因子（OCT4、SOX2和NANOG，合称OSN）形成不同的调控模块，而不是共同作用。

为了探究ZNF263的功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建了ZNF263敲除的hESC系。令人惊讶的是，ZNF263缺失的hESC表现出更加紧凑的集落形态，碱性磷酸酶（AP）活性显著升高，多能性表面标志物TRA-1-81和SSEA-3的表达也增加，表明这些细胞的多能性状态发生了改变。转录组分析显示，ZNF263缺失导致多能性基因上调和分化基因下调，破坏了primed状态的基因表达平衡。

机制研究表明，ZNF263通过两种主要方式调控基因表达：一方面直接激活早期分化基因（称为ZDA基因），这些基因大多具有bivalent启动子（同时含有H3K4me3和H3K27me3修饰）；另一方面直接抑制多能性基因（称为ZDR基因）。更重要的是，研究人员发现ZNF263与神经外胚层关键调控因子ZIC2形成正向反馈环路，共同促进分化基因的表达。

研究人员还深入探讨了ZNF263在hESCs分化过程中的作用。发现ZNF263缺失显著损害了细胞对MEK抑制剂诱导的多能性状态解离（PSD）的响应能力，影响了Wnt/β-catenin等关键发育信号通路的正常激活。在胚胎体（EB）分化实验中，ZNF263缺失的hESCs形成的EB体积较小，多能性基因POU5F1的沉默延迟，谱系标志物的诱导也受到显著影响。特别值得注意的是，ZNF263缺失对ectoderm分化的影响最为显著。

单细胞转录组分析进一步揭示了ZNF263在塑造hESC异质性中的重要作用。野生型hESCs中存在向中内胚层和外胚层不同分化倾向的细胞亚群，而ZNF263缺失则显著减少了这些具有高谱系分化潜能的细胞比例。

本研究采用的关键技术方法包括：基于表观基因组数据的计算生物学筛选（MAmotif分析）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、CRISPR/Cas9基因编辑技术、RNA测序（包括bulk和单细胞RNA-seq）、CUT&Tag技术（用于ZIC2结合位点分析）、流式细胞术分析细胞表面标志物，以及胚胎体形成和三胚层定向分化实验。所有实验均使用H1和H9两种hESC系进行验证。

ZNF263广泛结合与多能性和干细胞分化相关基因的启动子

研究人员通过FLAG标签的ChIP-seq实验在H1 hESCs中鉴定出22,966个ZNF263结合峰，其中9,744个位于基因启动子区域。这些ZNF263结合的启动子大多数处于活性状态（H3K4me3⁺）或bivalent状态（H3K4me3⁺H3K27me3⁺），显著富集于干细胞多能性调控信号通路和干细胞分化相关基因。这表明ZNF263选择性结合在hESCs中 actively转录或准备转录的基因启动子上。

ZNF263与核心多能性因子形成不同的调控模块

通过系统分析ZNF263与其他转录因子在活性顺式调控元件（aCREs）上的共定位情况，研究人员发现ZNF263与OSN因子属于不同的调控模块。在启动子aCREs上，ZNF263与P300、RAD21等转录共激活子和染色质环化因子显著共定位，而在远端aCREs上，许多因子转而与OSN因子而不是ZNF263共定位。这表明ZNF263在primed hESCs的启动子调控中发挥着中心作用。

ZNF263通过抑制多能性基因和激活分化基因来维持primed多能性状态

功能实验表明，ZNF263缺失导致多能性基因（如PRDM14）上调和分化基因（如ZIC5、ZNF521、SOX9）下调。这些变化伴随着染色质状态的改变：ZDA bivalent基因的启动子显示H3K4me3减少和H3K27me3增加，而ZDR活性基因的启动子显示H3K4me3和H3K27ac增加。时间进程RNA-seq数据分析进一步显示，ZDA bivalent基因在定形内胚层（DE）和外胚层神经（EN）分化的早期阶段被激活，表明ZNF263 priming这些基因以便在后续分化中快速激活。

ZNF263与ZIC2形成feed-forward环路促进分化基因表达

研究发现ZNF263与ZIC2在染色质上显著共定位，特别是在ZDA基因的启动子和远端区域。ZNF263缺失导致ZIC2结合全局减少，特别是在ZDA基因附近。免疫共沉淀实验证实了ZNF263和ZIC2之间的物理相互作用。在ZNF263缺失的hESCs中过表达ZIC2只能部分挽救转录组扰动，表明整个ZNF263-ZIC2轴对于其功能至关重要。

ZNF263促进多能性状态解离和多谱系分化

MEK抑制剂处理实验显示，ZNF263缺失的hESCs在多能性状态解离方面存在缺陷，表现为AP活性下降不明显，多能性基因下调不充分，分化基因上调不足。这些细胞在Wnt/β-catenin信号通路激活方面也存在障碍。胚胎体形成实验和三胚层定向分化实验进一步证实，ZNF263缺失损害了hESCs向三个胚层的分化能力，特别是向外胚层的分化。

ZNF263通过促进发育潜能异质性为谱系承诺做准备

单细胞转录组分析发现，野生型hESCs中存在向中内胚层和外胚层不同分化倾向的细胞亚群，而ZNF263缺失显著减少了这些具有高谱系分化潜能的细胞比例。这表明ZNF263通过促进hESCs的发育潜能异质性，为后续的谱系承诺做准备。

本研究系统揭示了ZNF263作为primed多能性状态关键调控因子的全新功能。ZNF263通过双重调控机制——激活早期分化基因同时抑制核心多能性回路，在hESCs中建立并维持了primed多能性状态。它与ZIC2形成的feed-forward环路以及与其他分化相关信号通路（如Wnt/β-catenin）的交叉对话，确保了细胞在接收到分化信号时能够快速启动多能性退出和谱系分化程序。

这些发现不仅深化了我们对人类多能性调控网络的理解，也为早期胚胎发育特别是原肠胚形成和胚层特化的启动机制提供了重要见解。从转化医学角度，ZNF263的发现可能为干细胞定向分化和再生医学提供新的策略靶点。通过调控ZNF263活性，或许能够更有效地控制干细胞的多能性状态和分化方向，从而提高干细胞在疾病模型和细胞治疗中的应用效率。

该研究还提出了许多有趣的问题供未来探索，如ZNF263表达本身是如何在分化过程中被调控的，以及ZNF263过表达是否能够增强hESCs的分化效率等。这些问题的解答将进一步丰富我们对多能性状态转换和细胞命运决定机制的认识。